槲皮素對內(nèi)分泌耐藥乳腺癌三苯氧胺治療增敏作用的體內(nèi)研究

王紅鮮，林秋生，吉坤美，郭芬芬，陳天文，胡璟，孔恒，蔡澤浪

（1. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬深圳南山醫(yī)院 甲乳外科，廣東 深圳 518052；2. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣東 深圳 518060；3. 中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣東 廣州 510080）

自1962年Jensen等[1]成功分離出雌激素受體（estrogen receptor，ER），奠定了乳腺癌內(nèi)分泌治療的分子基礎(chǔ)，長期以來的臨床實(shí)踐確立了乳腺癌內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)——三苯氧胺（tamoxifen，TAM）的一線治療地位，并使眾多患者獲益。然而有學(xué)者[2-3]發(fā)現(xiàn)40%初始抗雌激素治療有效的ER陽性乳腺癌患者，隨著療程的延長會出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，而且一旦發(fā)生耐藥，雌激素受體調(diào)節(jié)類藥物（SERMs）反而會促進(jìn)腫瘤的生長。獲得性雌激素受體抑制劑耐藥的問題日益嚴(yán)重，第32屆圣安東尼奧乳腺癌大會（SABCS，2009年）首次報(bào)道醛糖還原酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌耐藥細(xì)胞的耐藥性，初步闡明其機(jī)制是通過上調(diào)ERα及下調(diào)HER-2/MAPK的水平[4]。槲皮素（quercetin，QUE）是一種天然植物來源的黃酮類醛糖還原酶抑制劑，具有多種抗腫瘤活性，其機(jī)制可能是其具有抑制多種腫瘤細(xì)胞的MAPK、Akt信號系統(tǒng)活性[5-7]，對乳腺癌細(xì)胞，QUE能夠下調(diào)HER-2的表達(dá)[8]。本實(shí)驗(yàn)以耐TAM人乳腺癌荷瘤裸鼠為主要研究對象，從實(shí)驗(yàn)動物水平觀察QUE誘導(dǎo)下TAM對移植瘤的療效，并初步探討其作用的分子機(jī)制，以期為臨床治療提供一個新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中科院上海細(xì)胞資源中心，SPF級BALB/c-nu雌性裸小鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液和0.25%胰蛋白酶購于Gibico公司，QUE、4-羥三苯氧胺（4-hydroxytamoxifen，4-OH-TAM）購自Sigma公司，枸櫞酸三苯氧胺（tamoxifen citrate tablets）為阿斯利康公司產(chǎn)品，RIPA蛋白裂解液（強(qiáng)）、PMSF蛋白酶抑制劑、Bradford蛋白濃度測定試劑盒等為碧云天公司產(chǎn)品。抗-ERα、抗-actin購自Santa Cruz，抗-pAkt、抗-MAPK購自Cell Signaling公司，抗-HER-2、抗-Akt、抗-pMAPK、羊抗兔IgG-HRP等購自CST。

1.2 構(gòu)建TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞株

常規(guī)培養(yǎng)雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，采用高濃度短時間，4-OH-TAM沖擊法[9]誘導(dǎo)人乳腺癌TAM耐藥細(xì)胞株MCF-7/TAM-R：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，加入4-OH-TAM（終濃度10-6mol/L）并每2～3天換液（含等濃度4-OH-TAM）1次。在上述培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)21 d，收獲乳腺癌TAM耐藥細(xì)胞株MCF-7/TAM-R，并在無藥物干預(yù)下擴(kuò)增，在含耐藥維持濃度為10-7mol/L的4-OH-TAM培養(yǎng)液中維持MCF-7/TAM-R的耐藥性。

1.3 TAM耐藥乳腺癌動物模型的構(gòu)建及分組

1.3.1 建立人TAM耐藥乳腺癌動物模型 ⑴ 細(xì)胞接種法制備裸鼠皮下移植瘤模型：BALB/c-nu雌性裸小鼠 3只，4～5周齡，體質(zhì)量 14～18 g，在SPF屏障系統(tǒng)（恒溫、恒濕、無菌、凈化）中飼養(yǎng)；取對數(shù)生長期的人乳腺癌TAM耐藥細(xì)胞MCF-7/TAM-R，常規(guī)胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，PBS液清洗2次并重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5.0×107/mL，每只裸鼠接種0.2 mL MCF-7/TAM-R單細(xì)胞懸液（含細(xì)胞5×106個）于一側(cè)背部皮下形成皮丘（避免注射到皮內(nèi)，穿刺點(diǎn)無液體溢出），觀察接種部位腫瘤生長狀況，以瘤塊直徑達(dá)1.0 cm為造模標(biāo)準(zhǔn)。⑵ 組織塊法制備裸鼠皮下移植瘤模型：細(xì)胞接種法制備皮下移植瘤模型成功，斷頸處死裸鼠，無菌環(huán)境中完整剝離皮下腫瘤作為移植瘤源，剔除周圍結(jié)締組織及腫瘤部分壞死組織。取生長活躍的腫瘤邊緣組織，無菌生理鹽水漂洗后，眼科剪修剪為約2～3 mm3的小組織塊，置無菌生理鹽水中備用。取4～5周齡BALB/c-nu雌性裸小鼠24只，體質(zhì)量14～18 g，消毒右側(cè)頸背部皮膚，眼科剪剪開一長約2～4 mm小口，適當(dāng)游離皮下疏松組織形成一小隧道；眼科鑷夾取備好的腫瘤小組織塊置入皮下，輕輕壓迫、閉合皮膚切口（圖1）。觀察腫瘤生長情況及致瘤率，以瘤體直徑超過0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 組織塊法制備裸鼠皮下移植瘤Figure 1 Subcutaneous tumor transplantation with tumor tissue blocks

1.3.2 荷瘤動物分組 達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn)后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只。⑴ 對照組：二甲基亞砜（DMSO，QUE的空白溶媒，等容積腹腔內(nèi)注射，1次/2 d）+生理鹽水（TAM的空白溶媒，等容積灌服，1次/1 d） 處 理， 至 第21天。 ⑵ QUE組：QUE（50 mg/kg，DMSO稀釋腹腔內(nèi)注射，1次/2 d）[10]+生理鹽水（TAM的空白溶媒，等容積灌服，1次/1 d）處理，至第21天；⑶ TAM組：TAM（5 mg/k，生理鹽水稀釋灌服，1次/1 d）[11]+DMSO（腹腔內(nèi)注射，1次/2 d）處理，至第21天；⑷ QUE+TAM組：QUE（50 mg/kg，DMSO稀釋腹腔內(nèi)注射，1次/2 d）+TAM（5 mg/kg，生理鹽水稀釋灌服，1次/1 d）處理，至第21天。

1.3.3 各組荷瘤裸鼠體質(zhì)量、瘤體體積與瘤體質(zhì)量 注藥前、注藥后每3天測量各組荷瘤裸鼠體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量曲線；用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和與之垂直的最短徑（b），根據(jù)公式計(jì)算瘤體體積：V（cm3）＝ab2×0.52[12]，繪制瘤體生長曲線；21 d后拉頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤，測量瘤體質(zhì)量。

1.4 Western blot檢測瘤組織ERα、HER-2、pMAPK、MAPK以及pAkt、Akt蛋白表達(dá)

常規(guī)RIPA及PMSF提取各組瘤體組織總蛋白，12%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，置5%的脫脂奶粉-PBST封閉液中室溫封閉2 h，分別于稀釋的一抗：抗-ERα、抗-HER-2、抗-pMAPK、抗-MAPK以及抗-pAkt、抗-Akt中4 ℃過夜。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（羊抗兔IgG-HRP）平穩(wěn)搖動、室溫孵育2 h，ECL顯色，置于X光片盒中，壓片曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞制備及模型成功率

用4-OH-TAM高濃度（10-6mol/L）、短時間持續(xù)沖擊方法成功構(gòu)建MCF-7/TAM-R細(xì)胞。在4-OH-TAM篩選初期，即篩選的第5～10天，MCF-7細(xì)胞的增殖活力明顯受抑，可以觀察到有較多的MCF-7細(xì)胞死亡；而到了篩選后期幾乎無新的細(xì)胞死亡發(fā)生。篩選獲得的4-OH-TAM耐藥細(xì)胞株與親代MCF-7細(xì)胞從形態(tài)上比較，沒有明顯差別（圖2），MCF-7/TAM-R構(gòu)建成功。

將瘤源組織塊置入裸鼠右側(cè)頸背部皮膚皮下，1周內(nèi)全部達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成瘤率為100%（24/24）。

圖2 親代MCF-7細(xì)胞和TAM耐藥MCF-7細(xì)胞形態(tài)觀察（×100）Figure 2 Morphologic observation of the parent MCF-7 and TAM-resistant MCF-7 (×100)

2.2 各組荷瘤裸鼠的體質(zhì)量、瘤體體積與瘤體質(zhì)量變化情況

2.2.1 體質(zhì)量變化 在用藥前期，即用藥的前12 d，各組動物攝食良好、活動正常，體質(zhì)量逐漸增長，TAM組動物體質(zhì)量增長相對緩慢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。2周后QUE+TAM組和QUE組裸鼠攝食減少、體質(zhì)量減輕，動物消瘦、行動遲緩；第18～21天QUE+TAM組動物體質(zhì)量明顯減輕（均P＜0.05），出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、萎靡，部分動物瀕臨死亡；相對于QUE+TAM組，上述表現(xiàn)在QUE組動物稍輕。而對照組、TAM組動物飲食、活動正常，體質(zhì)量無明顯變化（P＞0.05）（圖3）。

2.2.2 瘤體體積 對照組、TAM組、QUE組動物的瘤體呈持續(xù)增長，其中以TAM組瘤體增長最為迅速，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而QUE組增長速度相對緩慢、瘤體較小，但亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。QUE+TAM組在用藥的前12 d，瘤體呈逐漸增長趨勢，與各對照組基本一致；12～15 d增長速度接近于平臺期；而到實(shí)驗(yàn)后期（18～21 d），瘤體生長呈下降趨勢，逐漸變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖3 各組荷瘤裸鼠體質(zhì)量變化Figure 3 Changes of body weight of the tumor-bearing nude mice in each group

圖4 各組荷瘤鼠移植瘤生長趨勢Figure 4 Growth tendency of the xenografts in each groups of mice

2.2.3 瘤體質(zhì)量 在給藥后第21天，24只動物均存活，大體解剖未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，完整剝離皮下腫瘤、稱重（圖5A）。與其余各組比較，QUE+TAM組的瘤體質(zhì)量明顯降低（均P＜0.05）；其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但QUE組的瘤體質(zhì)量小于其他兩組（圖5B）。

圖5 給藥后第21天各組移植瘤情況Figure 5 Xenografts in each group at the 21th day of treatment

2.3 瘤組織中ERα、HER-2、pMAPK、MAPK、pAkt、Akt蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，QUE+TAM組和QUE組瘤組織中ERα蛋白的表達(dá)明顯升高，而HER-2、pERK、pAkt蛋白的表達(dá)明顯降低，而TAM組以上蛋白表達(dá)無明顯差異；非酸化的ERK、Akt蛋白表達(dá)水平在各組間均無明顯差異（圖6）。

圖6 瘤組織中ERα、HER-2、pMAPK、pAkt、MAPK、Akt蛋白表達(dá)檢測Figure 6 Determination of protein expressions of ERα, HER-2,pMAPK, pAkt, MAPK and Akt

3 討 論

乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的主要原因是ERα和HER-2信號通路的串話調(diào)節(jié)（cross talk）。抑制一個信號通路，可使腫瘤細(xì)胞在強(qiáng)大的生存壓力下激活另一個信號通路，得以繼續(xù)增殖、侵襲和遷移，產(chǎn)生耐藥性。生長因子信號通路的異常激活，使其下游信號通路Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt-mTOR通路的過度活化，活化的ERK和Akt激酶促使ER的AF-1及其共調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵位點(diǎn)磷酸化，出現(xiàn)不依賴配體的ER激活途徑，是內(nèi)分泌治療耐藥的非配體依賴性活性的主要通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸[13-15]。

探討HER-2或其下游信號通路Ras-Raf-MEKERK和PI3K-Akt-mTOR的信號通路的抑制劑，恢復(fù)內(nèi)分泌治療的敏感性迫在眉睫。Miller等[16]的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)顯示，用HER-2的單克隆抗體曲妥珠單抗或拉帕替尼抑制乳腺癌細(xì)胞中HER-2的表達(dá)，能夠增強(qiáng)ER轉(zhuǎn)錄活性，促使ER表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)細(xì)胞對內(nèi)分泌藥物的敏感性。在來曲唑長時間處理的乳腺癌細(xì)胞LTLT-Ca中，Jelovac等[17]發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系中HER-2、p-Raf、p-MEK1/2及p-MAPK表達(dá)上調(diào)，以致細(xì)胞耐藥后磷酸化ER水平提高，導(dǎo)致非配體依賴的ER轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，雖然ER水平是下降的；而應(yīng)用MAPK通路抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼，LTLT-Ca細(xì)胞的生長受到抑制，對來曲唑的敏感性恢復(fù)。Macedo等[18]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用曲妥株單抗能恢復(fù)ER的表達(dá)水平，并恢復(fù)LTLT-Ca細(xì)胞對內(nèi)分泌治療的敏感性。PI3K-Akt-mTOR信號通路研究最為成熟的是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制劑依維莫司。Bachelot等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，依維莫司聯(lián)合TAM能顯著改善乳腺癌內(nèi)分泌治療的繼發(fā)耐藥。而在芳香化酶抑制劑治療失敗的ER陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，依維莫司聯(lián)合TAM能顯著延長無進(jìn)展生存時間（PFS）和總生存期（OS）[20]。

從天然植物來源中尋找有效逆轉(zhuǎn)TAM耐藥的化合物，是一種較為理想的選擇。QUE一種天然植物來源的黃酮類活性小分子，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞MAPK、Akt信號系統(tǒng)活性[5-7]，干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[21-23]、抗腫瘤血管生成[24]等活性。對乳腺癌細(xì)胞，QUE能夠使HER-2的表達(dá)下調(diào)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)的第12天，QUE+TAM組瘤體的生長呈下降趨勢，體積逐漸變小，并且在結(jié)束用藥后，QUE+TAM組的瘤體質(zhì)量量顯著降低，表明在QUE誘導(dǎo)下，TAM可使人乳腺癌內(nèi)分泌耐藥荷瘤鼠瘤體的生長顯著受抑；進(jìn)而，在對信號通路及分子機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，QUE下調(diào)耐藥移植瘤組織中HER-2、pERK、pAkt的表達(dá)水平，由此阻斷了HER-2與ERα的串話調(diào)節(jié)通路，并且使ERα表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)腫瘤組織對內(nèi)分泌藥物的敏感性。

筆者在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中顯示實(shí)驗(yàn)動物在每天1次腹腔內(nèi)注射QUE（50 mg/kg）時，容易形成腹水，同時動物攝食、活動減少，消瘦，反應(yīng)遲鈍，提示QUE具有潛在的毒副作用，為保證動物存活，研究如期進(jìn)行，由此改良給藥頻次，由文獻(xiàn)[10]報(bào)道的“QUE（50 mg/kg）1次/1 d腹腔內(nèi)注射”改良為“QUE（50 mg/kg）1次/2 d腹腔內(nèi)注射”。改良后的QUE給藥頻次并不影響其內(nèi)分泌耐藥的增敏效應(yīng)，但卻不具有文獻(xiàn)[10]報(bào)道的顯著性抑瘤效果，只是相對地使瘤體增長速度減慢、重量減輕。從移植瘤的生長趨勢上，以TAM組瘤體增長最為迅速，提示TAM可能促進(jìn)對內(nèi)分泌耐藥乳腺癌腫瘤的生長，與Schiff等[3]的研究報(bào)道一致，但本研究中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，需要進(jìn)一步通過擴(kuò)大樣本量、延長給藥時間或改進(jìn)操作技術(shù)等研究來明確。

乳腺癌內(nèi)分泌耐藥帶來的高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和高病死率，使得開發(fā)有效的逆轉(zhuǎn)藥物迫在眉睫。本文的研究提示，在QUE誘導(dǎo)下，TAM恢復(fù)對裸鼠乳腺癌內(nèi)分泌耐藥移植瘤的抑制效應(yīng)，然而臨床上乳腺癌TAM耐藥的病因復(fù)雜，動物模型不能完全模擬出人體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，臨床效果及安全性方面還有待進(jìn)一步論證。另外，盡管有文獻(xiàn)[25]報(bào)道QUE對正常細(xì)胞毒性較小，仍有不少學(xué)者對QUE的藥用安全性提出了質(zhì)疑，本研究的結(jié)果也顯示QUE能導(dǎo)致動物攝食減少、消瘦，失去活力，后期動物體質(zhì)量明顯減輕，部分動物瀕臨死亡，其潛在的毒副作用、安全范圍及有效劑量有待進(jìn)一步探討。

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