Maspin在原發(fā)性膽管癌組織中的表達及其臨床意義

王逸君，袁偉杰，王志明，許可

（湖南省郴州市第一人民醫(yī)院 1. 急診科 3. 重癥醫(yī)學科，湖南 郴州 423000；2. 中南大學湘雅醫(yī)院 普通外科，湖南 長沙410008）

膽管癌是一種具有很強侵襲力的惡性腫瘤，預后差，5年無瘤生存率僅為12.8%，中位生存時間僅1.5年[1]，但膽管癌的發(fā)生與發(fā)展的機制尚未完全探明[2-4]。最近研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物Maspin與腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移有關，因此本研究檢測Maspin蛋白在原發(fā)性膽管癌中的表達及其與p53表達的相關性，并探討其與預后的臨床意義，從而為膽管癌的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源及處理 膽管癌組織連同癌旁組織（自距腫瘤邊緣約1.0 cm的組織）42例，收集于2006年7月—2011年10月湘雅醫(yī)院經(jīng)過外科手術并經(jīng)湘雅醫(yī)院病理科明確診斷的膽管癌患者，其中男27例，女15例；年齡37～78歲，平均（61.98±9.60）歲，術前均未作放療、化療、免疫治療。按WHO病理分級標準分：高分化癌23例，中分化癌11例，低分化癌8例。按病理類型分：管狀腺癌25例，乳頭狀腺癌10例，黏液腺癌7例。按腫瘤部位分：肝門部17例，膽總管中段12例，膽總管下段13例。按淋巴結轉移分：淋巴結轉移17例，無淋巴結轉移25例。按遠處轉移分：遠處轉移11例，無遠處轉移31例。正常膽管組織12例，標本均取自肝膽管結石患者行Roux-en-Y膽腸吻合的正常膽管組織，其中男7例，女5例；年齡32～75歲，平均（46.34±11.3）歲。上述組織放入10%福爾馬林中固定，并包埋在石蠟塊中，以備免疫組化用，蠟塊作3～4 μm的切片3張，其中1張行HE常規(guī)染色，另2張分別行Maspin、p53免疫組化檢測，且HE常規(guī)染色均經(jīng)湘雅醫(yī)院病理科高年資醫(yī)生病理檢查證實。

1.1.2 抗體 小鼠抗人Maspin單克隆抗體（EAW2，Cat.#MS-1767-S0）， 購自美國NeoMarkers公司（Frement，CA，USA），適用的稀釋濃度分別為1:10。小鼠抗人p53單克隆抗體（DO-7）購自北京中杉金橋公司，適用的稀釋濃度分別為1:50。免疫組化試劑盒購自上海晶美生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學步驟 采用SP法檢測Maspin與p53的表達。檢測方法按試劑盒說明書進行，用已知陽性的正常前列腺組織切片作為Maspin的陽性對照。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結果判斷 每張切片隨機連續(xù)觀察5個高倍視野，每處視野計數(shù)100個細胞。Maspin免疫組化染色以細胞漿或/和胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，結果判定標準：Maspin以細胞漿和/或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，采用半定量積分法統(tǒng)計檢測結果。具體評分標準[7]按⑴ 著色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，深棕黃色為3分；⑵ 陽性細胞數(shù)：無陽性細胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。⑴⑵項相加，0～2分為陰性（-），3～4分為陽性（+），5～6分為強陽性（++）。p53免疫組化染色以細胞核中出現(xiàn)棕黃色物質為陽性表達（+），無棕黃色物質為陰性表達（-）。

1.2.3 隨訪 通過書信及電話進行隨訪，預后觀察起始點為：開腹手術日期，觀察終點為死亡日期或本研究最后隨訪時間（2016年10月）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用四格表資料的χ2檢驗或Fisher確切概率法，Wilcoxon秩和檢驗，雙變量Spearman's相關分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗對術后生存率分析，采用Cox回歸模型進行多因素生存分析。生存時間以月計算，自手術當天起開始計算生存時間，患者死亡或失訪定為隨訪結束點。檢驗結果取雙側，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Maspin蛋白與p53蛋白在膽管癌組織中的表達

在42例原發(fā)性膽管癌組織中Maspin蛋白陽性率為73.8%，42例膽管癌旁組織和12例正常膽管組織Maspin蛋白陽性率分別為21.4%和16.7%，Maspin蛋白陽性率明顯高于癌旁組（χ2=23.1，P=0.000）和正常膽管組（χ2=10.5，P=0.01）；在42例原發(fā)性膽管癌組織p53蛋白陽性率為45.2%，在42例膽管癌旁組織和12例正常膽管組織p53蛋白陽性率均為0，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=22.0，P=0.000；χ2=6.5，P=0.01）（圖1）（表1）。

圖1 免疫組化檢測結果（×100） A：膽管癌組織Maspin陽性表達；B：膽管癌組織p53陽性表達；C：膽管癌組織Maspin陰性表達Figure 1 Immunohistochemical staining findings A: Positive Maspin expression in cholangiocarinoma tissue; B: Positive p53 expression in cholangiocarinoma tissue; B: Negative Maspin expression in cholangiocarinoma tissue

表1 Maspin蛋白與p53蛋白在膽管癌、癌旁組織和正常膽管組織中的表達情況[n（%）]Table 1 The expressions of Maspin and p53 protein in cholangiocarinoma, tumor adjacent tissue and normal biliary duct tissue [n (%)]

2.2 Maspin與p53蛋白表達與膽管癌臨床病理特征的相關性分析

Maspin蛋白表達與膽管癌淋巴結轉移（χ2=4.747，P=0.029）以及遠處轉移（χ2=4.306，P=0.037）有關，與年齡、性別、腫瘤部位、病理類型、病理分級以及TNM分期無關（均P＞0.05）；p53蛋白表達與膽管癌病理分級、TNM分期、淋巴結轉移以及遠處轉移有關（均P＜0.05），與年齡、性別、病理類型、腫瘤部位無關（均P＞0.05）（表2）。

表2 Maspin、p53表達與患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table 2 Relations of Maspin and p53 expression with cliniopathologic features the patients [n (%)]

2.3 膽管癌組中Maspin與p53蛋白表達之間的相關性

通過雙變量Spearman's相關分析法可知，Maspin與p53蛋白表達無相關性（r=-0.329，P=0.144）（表3）。

表3 膽管癌組織中Maspin與p53蛋白表達之間的相關性分析（n）Table 3 Correlation between Maspin and p53 protein expressionsin cholangiocarinoma tissue (n)

2.4 Maspin及p53蛋白表達與膽管癌術后生存時間的關系

42例膽管癌患者獲得隨訪患者有38例，失訪4例，隨訪率90.5%。Maspin蛋白陽性與Maspin蛋白陰性的患者術后生存時間分別為（18.7±3.1）個月與（8.4±1.5）個月；術后中位生存時間分別為13個月與8個月。p53陽性與p53陰性的患者術后平均生存時間分別為（9.3±1.2）個月與（22.0±4.0）個月；術后中位生存時間分別為8個月與15個月。

采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線（圖2）及生存曲線Log-rank檢驗顯示，Maspin陽性表達與陰性表達的患者術后生存時間之間的差別有統(tǒng)計學意義（χ2=4.440，P=0.035），Maspin陽性表達患者較陰性表達患者術后生存期延長。p53陽性表達與陰性表達的患者術后生存時間之間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.231，P=0.004），p53陰性表達患者較陽性表達患者術后生存期延長。

單因素總體生存率分析結果表明TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移以及Maspin表達可預測膽管癌患者預后（均P＜0.05）（表4）；多因素Cox回歸模型分析結果表明淋巴結轉移、遠處轉移以及Maspin表達是膽管癌患者預后的獨立影響因素（均P＜0.05）（表5）。

圖2 不同Maspin和p53狀態(tài)膽管癌患者的生存曲線Figure 2 Survival curves of cholangiocarinoma patients with different statuses of Maspin and p53 expression

表4 單因素總體生存率分析Table 4 Univariate analysis of factors for overall survival rates

表5 多因素Cox回歸模型分析結果Table 5 Analysis results of multivariate Cox regression model

3 討 論

Maspin屬于絲氨酸家族的一種新型絲氨酸蛋白酶抑制劑, 它歸屬于SERPIN超家族,是Zon等[8]于1994年采用雜交消減技術于正常乳腺上皮組織中發(fā)現(xiàn)的。與正常的乳腺組織相比, Maspin在相應的乳腺癌中表達明顯下降, 其功能相當于抑癌基因[9]。但在最近研究[10-11]發(fā)現(xiàn)與之相反的結論，在胃癌與子宮內(nèi)膜腺癌中頻繁檢測到Maspin的反常表達。筆者[12]在前期研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺癌中Maspin蛋白陽性率高達48.5%(32/66)，而在甲狀腺良性病變和正常甲狀腺組織均不表達。Xu等[13]論證這種反常的表達可能與Maspin基因5'端調(diào)節(jié)區(qū)的脫甲基相關，他們證實，Maspin蛋白是通過對CpG島（CpG島是由CpG二核苷酸序列聚集而成）脫甲基作用來抑制細胞裂解，從而改變Maspin的表達。

最近Kanzawa等[5]報道，Maspin在膽管癌中表達增強：良性增生上皮（20%）、膽道上皮內(nèi)瘤（＜50%）、侵入性膽管癌（＞90%）。本研究也發(fā)現(xiàn)了這種反常表達，與正常膽管組織及癌旁組織相比，Maspin蛋白在膽管癌中高表達。這種反常表達與乳腺癌[9,14]、前列腺癌[15]和口腔癌[16]中表達完全相反。在膽管癌致癌機理中，Maspin可能充當一個異于尋常的角色，在膽管癌變一系列過程中，Maspin的表達可能具有獨有的特性，可以推斷膽管癌變過程與其他類型的腫瘤可能不同。本研究示，Maspin蛋白在膽管癌中表達升高，提示了Maspin蛋白可能是膽管癌腫瘤標志物之一，這在鑒別膽管癌有一定價值。

Dabiri等[9,17]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中Maspin蛋白可以通過增加細胞的黏附能力和減低細胞的運動能力來抑制腫瘤浸潤。Amir等[18]研究結果表明,Maspin能抑制前列腺癌細胞表面的尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物（uPA），uPA能降低腫瘤細胞的浸潤。Dzinic等[19]研究結果也表明，Maspin蛋白能抑制前列腺癌細胞的復發(fā)與擴散。最新研究報道，在惡性黑素瘤[20]及皮膚鱗癌[21]中，Maspin表達缺失可導致腫瘤轉移與擴散，同樣佐證了Maspin在惡性黑素瘤及皮膚鱗癌中具有腫瘤抑制作用。在本研究中，Maspin蛋白表達與膽管癌淋巴結轉移以及遠處轉移有關，隨著膽管癌細胞的侵襲性加劇，而Maspin蛋白表達反而下調(diào)，提示了Maspin在膽管癌中同樣具有腫瘤抑制功能。

Chen等[22]最新研究結果表明，在肝細胞癌中Maspin低表達患者的總體生存率明顯下降。本研究中，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及生存曲線Log-rank檢驗顯示，Maspin陽性表達患者術后生存期延長，單因素分析和多因素Cox回歸模型分析結果也表明，Maspin表達是膽管癌患者預后的獨立影響因素，Maspin蛋白表達可作為預測膽管癌患者預后的指標。

目前更精確的Maspin蛋白的細胞學活性和生物化學活性尚不清楚[23]。Celik等[24]最近研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸腫瘤中，p53表達可能影響Maspin表達，p53與Maspin表達正相關。而Choy等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在肺鱗癌中，p53能激活Maspin表達的啟動子，p53與Maspin表達存在著正相關，但在肺腺癌中，p53與Maspin表達無相關。本研究結果也顯示膽管癌組織中Maspin蛋白與p53蛋白表達無相關性。這可能與樣本量的大小可能有關。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)，Maspin蛋白在膽管癌組織中表達增加, 提示了Maspin蛋白可能是膽管癌腫瘤標志物之一，其表達減少或缺失與患者不良臨床病理特征及預后密切相關，Maspin蛋白有可能作為預測膽管癌患者預后因子，并可望作為生物治療的作用靶點。但Maspin蛋白更精確的作用機制還有待我們更進一步探索。

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