A抗原減弱表型的基因分析*

馬曉莉，馬宏偉#，金新莉，楊賀才，陳 贊

1)河南省紅十字血液中心血型室 鄭州 450000 2)河南省紅十字血液中心檢驗(yàn)科 鄭州 450000 3)河南省紅十字血液中心科研外事科 鄭州 450000

A抗原減弱表型的基因分析*

馬曉莉1)，馬宏偉1)#，金新莉2)，楊賀才3)，陳 贊1)

1)河南省紅十字血液中心血型室 鄭州 450000 2)河南省紅十字血液中心檢驗(yàn)科 鄭州 450000 3)河南省紅十字血液中心科研外事科 鄭州 450000

#通信作者，男，1972年10月生，碩士，主任技師，研究方向：輸血免疫，E-mail：mubel666@163.com

抗原減弱；ABO血型；基因分析

目的：研究A抗原減弱的分子遺傳學(xué)背景。方法：用血清學(xué)的方法篩選出2015年1月至11月A抗原減弱的樣本6例，對其ABO基因的第6、7外顯子進(jìn)行測序分析。結(jié)果：6例中基因型為A102/O01有2例，A102/O02有1例，A102/B101有2例，1例樣本發(fā)現(xiàn)新的等位基因。結(jié)論：由于ABO基因的多態(tài)性，除了常見的第6、7外顯子上的基因突變引起抗原減弱外，第6、7外顯子以外的基因變異或轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)以及調(diào)控區(qū)域的異常都有可能導(dǎo)致A抗原減弱。

ABO血型自發(fā)現(xiàn)以來一直在臨床輸血及器官移植中占據(jù)著重要地位。按照抗原類型的不同可以分為A、B、O、AB四種血型，然而在臨床實(shí)踐中有時(shí)會(huì)遇到A抗原表達(dá)減弱甚至不表達(dá)的樣本，干擾了血清學(xué)的鑒定。造成這種現(xiàn)象的原因除了有常見的新生兒和疾病引起的抗原減弱外，還有一類較罕見的由遺傳方面引起的抗原表達(dá)減弱。作者收集了6例具有該特征的樣本，并對其進(jìn)行了血清學(xué)檢測和ABO基因測序，旨在進(jìn)一步了解A抗原減弱表型的分子遺傳學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 用血清學(xué)方法對2015年1月至11月期間鄭州市無償獻(xiàn)血者進(jìn)行檢測，將A抗原凝集強(qiáng)度反應(yīng)為2+以下的定義為抗原減弱，共6例。其中男性2例，女性4例，年齡在18～55歲。

1.2 試劑與儀器 抗A抗體、抗B抗體及ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞(美國Immucro公司)，單特異性/多特異性抗人球蛋白試劑、抗H抗體(上海市血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)，基因組DNA提取試劑盒(美國TBG公司)，Taq 酶(Promega公司)，PCR擴(kuò)增儀9700(美國ABI公司)，測序儀3130x(美國ABI公司)。

1.3 ABO血型的血清學(xué)檢測 用抗A抗體、抗B抗體做正定型， A細(xì)胞、B細(xì)胞、O細(xì)胞做反定型，并做抗H抗體和吸收放散實(shí)驗(yàn)。鹽水凝集試管法、吸收放散實(shí)驗(yàn)均按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)進(jìn)行操作。

1.4 ABO血型的基因測序

1.4.1 DNA的提取 采集3～5 mL外周血，用EDTA抗凝，按試劑說明書提取樣本DNA用于擴(kuò)增和測序分析。

1.4.2 ABO基因第6、7外顯子PCR擴(kuò)增 引物以ABO基因序列為模板設(shè)計(jì)， 第6外顯子引物序列為5’-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3’和5’-ATGTCCA CAGTCACTCGCCA-3’； 第7外顯子引物序列為5’-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3’和5’-GTTTACCCGT TCTGCTAA-3’。 引物由天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系包括：dNTP 400 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，10×PCR緩沖液5 μL，Taq酶0.5 U，模板DNA 500 ng，引物10 pmol/L，終反應(yīng)體系50 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；后72 ℃ 10 min。

1.4.3 ABO基因第6、7外顯子序列分析 采用直接測序的方法，用Chromas2.01軟件閱讀測序圖譜，以A101序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列，使用DANMAN5.22進(jìn)行序列比對。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)鑒定結(jié)果 見表1。

表1 6例樣本的血清學(xué)和基因測序結(jié)果

+：有反應(yīng)；-：無反應(yīng)；mf：混合視野；s：強(qiáng)度以上；w：強(qiáng)度以下。

2.2 基因測序判定結(jié)果 經(jīng)測序6例樣本的基因型分別為：A102/O01有2例，A102/O02有1例， A102/B101有2例， 1例樣本發(fā)現(xiàn)新的等位基因。新基因綜合結(jié)果判定見表2，突變部位見圖1。

表2 新基因綜合結(jié)果判定(以A101為標(biāo)準(zhǔn)序列)

Ins G：為堿基插入。圖1 新基因突變測序圖

3 討論

ABO基因存在A、B、O 三個(gè)等位基因，該基因并不直接產(chǎn)生抗原，而是產(chǎn)生特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，這些酶控制著ABO血型抗原的生成[1]。ABO血型抗原的弱表達(dá)主要原因是在ABO基因編碼區(qū)發(fā)生錯(cuò)義突變[2]。ABO基因有7個(gè)外顯子，在基因組上DNA超過18 kb，外顯子大小28～688 bp，第6和7外顯子占全部編碼序列的77%，編碼91%的酶催化區(qū)域，目前報(bào)道的ABO等位基因的點(diǎn)突變大多發(fā)生在該區(qū)域[3]。所以該實(shí)驗(yàn)對第6和第7外顯子的序列進(jìn)行了測序分析。結(jié)果顯示，1例獻(xiàn)血者的ABO基因其他突變點(diǎn)具有A102/O02特點(diǎn)，但第7外顯子發(fā)生817 Ins G，經(jīng)查詢NCBI未收錄該突變，應(yīng)為原生突變。由于Ins G的發(fā)生導(dǎo)致T→G，引起第273位絲氨酸替換為丙氨酸，致其下游氨基酸鏈發(fā)生改變，造成糖基轉(zhuǎn)移酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使糖基轉(zhuǎn)移酶的能力發(fā)生改變，最終表現(xiàn)為A抗原的減弱。

A102在中國人群的比例相當(dāng)高，是常見的基因型，有文獻(xiàn)報(bào)道，北京地區(qū)A102頻率為20.20%[4]，福州地區(qū)為36.49%[5]。A102與A101在分子層面相比，發(fā)生467位的單個(gè)堿基替換(C→T)，導(dǎo)致氨基酸Pro→Leu替換，兩者翻譯糖基轉(zhuǎn)移酶的活力沒有明顯差異。而作者的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：5例基因型為A102的樣本中，有4例樣本鹽水法檢測不出A抗原，只有通過吸收放散實(shí)驗(yàn)才能檢出，且強(qiáng)度普遍偏弱；剩下的1例強(qiáng)度也在中等以下；據(jù)此5例樣本都判斷為A亞型。但血清學(xué)實(shí)驗(yàn)容易受年齡、溫度等因素的干擾，可能會(huì)引起抗原凝集的減弱，雖然5例判為ABO亞型，但通過基因檢測技術(shù)確定了上述樣本為ABO常見型。由于實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了第6、7外顯子的測序，所以引起抗原減弱的原因也可能與第6、7外顯子以外的突變、轉(zhuǎn)錄及調(diào)控區(qū)域的異常等方面有關(guān)。這個(gè)觀點(diǎn)近年來也有研究驗(yàn)證，如喻瓊等[2]報(bào)道ABO基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化可引起抗原弱表達(dá)，金飛[6]報(bào)道抗原的減弱與糖基轉(zhuǎn)移酶的活性減弱有關(guān)。所以進(jìn)一步研究這些領(lǐng)域的分子機(jī)制將有助于理解有相同等位基因的個(gè)體卻產(chǎn)生不同的血清學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述，基因技術(shù)可以彌補(bǔ)血清學(xué)方法的不足，而血清學(xué)實(shí)驗(yàn)有著方便快捷直觀的優(yōu)勢，所以兩種方法不可相互替代，在實(shí)際操作中應(yīng)相結(jié)合互為補(bǔ)充，以便準(zhǔn)確地判斷ABO血型，保障臨床用血安全。由于ABO基因的多態(tài)性，除了常見的第6、7外顯子上的基因突變引起抗原減弱外， 第6、7外顯子以外的基因變異或轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)以及調(diào)控區(qū)域的異常都有可能導(dǎo)致A抗原減弱。今后作者將繼續(xù)積累樣本，進(jìn)一步研究導(dǎo)致A抗原減弱的分子調(diào)控機(jī)制。

[1]張嶸，蘇品璨，田力，等. 昆明地區(qū)無償獻(xiàn)血者ABO亞型的分子遺傳學(xué)分析[J].中國輸血雜志，2012，25(3)：219

[2]喻瓊，蘇宇清，甄建新，等. B弱亞型表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制研究[J].國際輸血及血液學(xué)雜志,2013,36(3):220

[3]池泉，張愛，任本春.B抗原減弱表型的表型頻率與ABO基因分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2013,28(12):1128

[4]劉長利，龔曉燕，王卓妍，等. 北京地區(qū)漢族人群AB0血型基因分型研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2008,16(2):425

[5]黃文華，卓孝福，林海娟，等. 福州地區(qū)漢族人群ABO血型系統(tǒng)基因型研究[J]. 國際輸血及血液學(xué)雜志,2014,31(1):16

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(2016-10-10收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Gene analysis of A antigen weakened phenotype

MAXiaoli1)，MAHongwei1)，JINXinli2)，YANGHecai3)，CHENZan1)

1)BloodTypeResearchLaboratory，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000 2)ClinicalLaboratory，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000 3)DepartmentofInternationalOffice-ResearchDevelopment，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000

antigen weakened; ABO blood type; gene analysis

Aim: To study the molecular genetic background of A antigen weakening by serologically detecting the A antigen weakened phenotype samples and ABO gene sequencing. Methods: Serological method was used to screen A antigen weakened samples blood donors of from during January 2015 to November 2015. The exons 6 and 7 of the ABO gene were amplified by PCR and sequenced. Results: There were 6 cases with A-antigen-attenuated type and their genotypes were A102/O01(2 cases), A102/O02(1 case), A102/B101(2 cases), and a new allele(1 case). Conclusion: Because of the ABO gene polymorphism, in addition to the the mutations in exons 6 and 7, other gene mutation or transcriptional structure as well as abnormalities of regulation region are likely to lead to A antigen weakening.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.021

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目 201503199

R392.7