不同類型子癇前期患者胎盤組織內(nèi)NFAT5、MCP-1的表達*

崔世紅，高亞南，張琳琳，劉 靈，吳 娟，陳 娟，申琳娜，職云曉

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)河南省產(chǎn)前基因檢測工程研究中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院B超室 鄭州 450052

不同類型子癇前期患者胎盤組織內(nèi)NFAT5、MCP-1的表達*

崔世紅1)△，高亞南1)，張琳琳2)，劉 靈1)，吳 娟3)，陳 娟1)，申琳娜1)，職云曉1)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)河南省產(chǎn)前基因檢測工程研究中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院B超室 鄭州 450052

△女，1961 年6月生，碩士，教授，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)，E-mail：1304519087@qq.com

子癇前期；NFAT5；MCP-1；妊娠結(jié)局

目的：檢測重度子癇前期患者胎盤組織中NFAT5、MCP-1的表達并探討二者與新生兒結(jié)局的關(guān)系。方法：采用免疫組化法檢測30例早發(fā)型重度子癇前期(早發(fā)型組)、30例晚發(fā)型重度子癇前期(晚發(fā)型組)及30例足月妊娠(對照組)孕婦胎盤組織中NFAT5、MCP-1蛋白的表達情況，采用RT-PCR法檢測胎盤組織中NFAT5、MCP-1 mRNA的表達情況，分析早發(fā)型組2種蛋白的相關(guān)性及與新生兒結(jié)局的關(guān)系。結(jié)果：3組胎盤組織中均有NFAT5和MCP-1蛋白的表達；早發(fā)型組2種因子的蛋白及mRNA表達水平均高于晚發(fā)型組(P<0.05)；晚發(fā)型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。早發(fā)型組胎盤組織中NFAT5與MCP-1蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.779，P<0.001)；而NFAT5和MCP-1蛋白分別與新生兒體重(r=-0.760、-0.560，P<0.05)、胎盤質(zhì)量(r=-0.583、-0.464，P<0.05)呈負相關(guān)。 結(jié)論：早發(fā)型子癇前期胎盤組織中NFAT5、MCP-1的表達均高于晚發(fā)型子癇前期，說明兩者可能有不同的發(fā)病機制。

子癇前期是妊娠期特有的一種復(fù)雜的多系統(tǒng)紊亂性疾病，以妊娠期高血壓為主要特征[1]。目前多以34周為界，將重度子癇前期分為早發(fā)型與晚發(fā)型子癇前期，并認為早發(fā)型與晚發(fā)型子癇前期可能存在不同的發(fā)病機制。早發(fā)型子癇前期發(fā)病早，病情進展快，低出生體重兒、早產(chǎn)和新生兒窒息的發(fā)生率高，多數(shù)有胎盤發(fā)育不良和子宮-胎盤灌注不足；而晚發(fā)型子癇前期患者胎盤發(fā)育相對正常，但母體可能存在新陳代謝或心血管系統(tǒng)異常[2]。近年來炎性反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷成為子癇前期研究的熱點。核轉(zhuǎn)錄因子5(NFAT5)是核轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-κB蛋白家族的一員，是惟一已知的與滲透壓轉(zhuǎn)錄相關(guān)的因子。最近研究[3]表明，NFAT5在子癇前期患者胎盤組織中表達升高。單核細胞趨化因子1(MCP-1)由巨噬細胞、滋養(yǎng)細胞、蛻膜細胞分泌，能夠趨化單核巨噬細胞聚集到損傷的血管內(nèi)皮周圍，促進炎性反應(yīng)[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，MCP-1啟動子部位存在NFAT5結(jié)合位點，NFAT5可與MCP-1啟動子部位DNA識別點結(jié)合，二者相互作用，激活下游信號通路，誘導(dǎo)大量炎性因子及TNF-α產(chǎn)生。該研究通過檢測NFAT5、MCP-1蛋白及mRNA在早發(fā)型及晚發(fā)型子癇前期患者胎盤組織中的表達，探討兩者在子癇前期發(fā)病中的作用，并分析兩者與新生兒結(jié)局的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年1月至2016年1月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院行剖宮產(chǎn)的60例重度子癇前期患者為研究對象，均符合文獻[6]診斷標準，且均未采取輔助生殖技術(shù)、自然受孕、單胎妊娠，既往均無高血壓、糖尿病、心臟病以及腎臟疾病史；該研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書；將其分為早發(fā)型組30例，晚發(fā)型組30例。另選同期正常孕婦30例作為對照組。

1.2 各組孕婦一般情況的搜集與整理 統(tǒng)計3組研究對象的年齡、分娩孕周、孕時BMI；待新生兒經(jīng)剖宮產(chǎn)娩出及胎盤娩出后，立即測量新生兒體重及胎盤質(zhì)量。

1.3 標本采集及處理 行剖宮產(chǎn)術(shù)時，在胎盤娩出15 min內(nèi)立即取母體面中央?yún)^(qū)域的胎盤組織約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 2塊，避開出血、梗死及鈣化區(qū)，4 ℃生理鹽水漂洗后置于無菌、無酶的1.5 mL EP管中，其中一塊立即投入液氮冷卻，后轉(zhuǎn)-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另一塊固定于體積分數(shù)10%甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.4 免疫組化法檢測胎盤組織中MCP-1、NFAT5蛋白的表達水平 石蠟標本連續(xù)切片，實驗步驟嚴格按照說明書進行。MCP-1、NFAT5單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(均按1150稀釋)，二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，以PBS代替一抗作為陰性對照。最后以DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色情況。在400倍鏡下選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，采用綜合計分法進行半定量分析[7]：以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致為陰性細胞；計算陽性細胞百分率，陽性細胞百分率<5%為0分，5%～為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分；根據(jù)細胞染色情況進行評分，無著色為0分，淺棕褐色為1分，棕褐色為2分，深褐色為3分；結(jié)果取兩者之和。

1.5 RT-PCR法檢測胎盤組織中MCP-1、NFAT5 mRNA的表達水平 提取總RNA(試劑購自北京康為試劑公司)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-PCR。MCP-1、NFAT5引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，NFAT5上游引物5’-GGGTCAAAC GACGAGATT-3’，下游引物5’-CAGAGTCGTTGCCCA CA-3’，片段大小375 bp；MCP-1上游引物5’-CCCCAGTCACCTGCTGTTAT-3’,下游引物 5’-TG GAATCCTGAACCCACTTC-3’，片段大小171 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游引物5’-CAGGAAGGAAG GCTCGAAGAGTG-3’，下游引物5’-GGGAAATCGT GCGTGACATTAAGG-3’，片段大小185 bp。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，共 40 個循環(huán)，重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，分別以NFAT5、MCP-1與β-actin條帶灰度值的比值作為NFAT5和MCP-1 mRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。3組孕婦的年齡、分娩孕周、孕時BMI、胎盤質(zhì)量、新生兒體重、胎盤組織中NFAT5及MCP-1蛋白和mRNA相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用直線相關(guān)分析早發(fā)型組NFAT5與MCP-1蛋白表達的相關(guān)性以及兩者分別與胎盤質(zhì)量和新生兒體重的相關(guān)性。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組孕婦的一般資料 結(jié)果見表1。

表1 3組孕婦一般資料比較

*:與其他2組比較，P<0.05。

2.2 各組胎盤組織中NFAT5與MCP-1蛋白的表達情況 NFAT5蛋白表達于各組胎盤滋養(yǎng)細胞中，大多位于胎盤滋養(yǎng)層與絨毛血管內(nèi)皮細胞的胞核與胞質(zhì)中，見圖1。MCP-1蛋白表達于絨毛血管內(nèi)皮細胞與胎盤滋養(yǎng)細胞中，主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，見圖2。 早發(fā)型組、晚發(fā)型組和對照組胎盤組織中NFAT5和MCP-1蛋白表達的比較，見表2。

A：早發(fā)型組胎盤組織；B：晚發(fā)型組胎盤組織；C：對照組胎盤組織。圖1 NFAT5蛋白在胎盤組織中的表達情況(SP，×400)

A：早發(fā)型組胎盤組織；B：晚發(fā)型組胎盤組織；C：對照組胎盤組織。圖2 MCP-1蛋白在胎盤組織中的表達情況(SP，×400)

表2 各組孕婦胎盤組織中NFAT5與MCP-1蛋白相對表達量的比較

*:與其他2組比較，P<0.05。

2.3 各組胎盤組織中NFAT5與MCP-1 mRNA的表達情況 結(jié)果見圖3、4和表3。

1：Marker；2～4：分別為對照組、晚發(fā)型組、早發(fā)型組；5～7：β-actin。圖3 各組孕婦胎盤組織中NFAT5 mRNA的表達情況

1：Marker；2～4：β-actin;5～7:分別為對照組、晚發(fā)型組、早發(fā)型組。圖4 各組孕婦胎盤組織中MCP-1 mRNA的表達情況

表3 各組孕婦胎盤組織中NFAT5及MCP-1 mRNA相對表達量的比較

*:與其他2組比較，P<0.05。

2.4 早發(fā)型子癇前期患者胎盤組織中NFAT5和MCP-1蛋白表達的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，早發(fā)型子癇前期胎盤組織中NFAT5與MCP-1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.779,P=0.001)。

2.5 早發(fā)型子癇前期患者胎盤組織中NFAT5和MCP-1蛋白表達與新生兒結(jié)局的關(guān)系 各組孕婦的胎盤質(zhì)量及新生兒體重見表4。相關(guān)分析結(jié)果顯示，早發(fā)型組胎盤組織中NFAT5蛋白表達與新生兒體重、胎盤質(zhì)量呈負相關(guān)(r=-0.760、-0.583，P均<0.05)； MCP-1蛋白表達與新生兒體重、胎盤質(zhì)量呈負相關(guān)(r=-0.560、-0.464，P均<0.05)。

表4 各組孕婦的胎盤質(zhì)量及新生兒體重比較 g

*:與其他2組比較，P<0.05；#：兩兩比較，P<0.05。

3 討論

子癇前期可導(dǎo)致母嬰患病率與死亡率升高。胎盤作為聯(lián)系孕婦與胎兒惟一的紐帶，具有物質(zhì)運輸、激素合成、防御病原體的功能。妊娠期間，早期胎盤發(fā)育處于低氧環(huán)境中，胎兒與母體已適應(yīng)了這種低氧狀態(tài)，然而持續(xù)缺氧會導(dǎo)致子癇前期和胎兒生長受限等妊娠并發(fā)癥。有學(xué)者[2，8-9]認為，早發(fā)型與晚發(fā)型子癇前期的發(fā)病機制不同，早發(fā)型重度子癇前期起源于胎盤，母胎界面的病理生理改變導(dǎo)致子宮螺旋小動脈生理重鑄障礙，胎盤淺著床，胎盤灌注減少，缺血缺氧，產(chǎn)生更多的毒性因子損害血管內(nèi)皮功能，最終導(dǎo)致惡性循環(huán)；而晚發(fā)型子癇前期患者胎盤發(fā)育相對正常，但母體本身可能存在新陳代謝或心血管系統(tǒng)異常。

NFAT5是Rel/NF-κB蛋白家族的一個成員[3]。最新研究[10]發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤組織內(nèi)NFAT5蛋白的表達與對照組相比明顯升高，而且在JAR細胞內(nèi)低氧可誘導(dǎo)NFAT5 mRNA的表達。Park等[3]通過雙重免疫熒光染色證實，NFAT5定位于胎盤組織的滋養(yǎng)細胞與絨毛血管內(nèi)皮細胞，其在子癇前期患者胎盤組織的表達水平高于對照組。Villanueva等[11]發(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)NFAT5的核轉(zhuǎn)錄與激活，然而在缺氧8 h后NFAT5表達降低導(dǎo)致細胞的凋亡與壞死增加。該研究中，作者采用免疫組化方法和RT-PCR法，分別檢測3組孕婦的胎盤組織中NFAT5蛋白和mRNA的表達情況，結(jié)果顯示，NFAT5在早發(fā)型組、晚發(fā)型組以及對照組胎盤組織滋養(yǎng)細胞及絨毛血管內(nèi)皮細胞中均有表達，但在早發(fā)型組胎盤組織中表達水平較高，提示早發(fā)型組胎盤病變嚴重，胎盤缺血缺氧，胎盤滋養(yǎng)細胞表達較多的NFAT5，而NFAT5可以改善滋養(yǎng)細胞在低氧環(huán)境中過高的張力，對于滋養(yǎng)細胞在缺血缺氧的環(huán)境中起到一種代償作用；然而晚發(fā)型組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進一步說明早發(fā)型子癇前期與晚發(fā)型子癇前期的發(fā)病機制不同，與既往研究[12]一致。

MCP-1作為趨化因子CC家族成員，與妊娠關(guān)系最為密切，可與其配體結(jié)合，促進滋養(yǎng)細胞遷移[13]。該研究結(jié)果顯示，MCP-1主要位于絨毛血管內(nèi)皮細胞與滋養(yǎng)細胞內(nèi)，提示MCP-1能趨化炎性因子聚集到血管內(nèi)皮細胞周圍，引起血管內(nèi)皮功能損傷。研究[14]發(fā)現(xiàn)，妊娠中晚期子癇前期患者血漿MCP-1水平顯著高于正常孕婦，且隨著病情加重而呈增加趨勢。該研究中作者發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中MCP-1蛋白表達在早發(fā)型組高于晚發(fā)型組，提示MCP-1水平與子癇前期發(fā)病程度密切相關(guān)。作者進一步分析發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)型組與對照組相比，MCP-1蛋白表達水平并無明顯差異，因此推測，晚發(fā)型子癇前期發(fā)病可能與胎盤關(guān)系不大。

最近Kojima等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在MCP-1的調(diào)節(jié)區(qū)域存在NFAT5的結(jié)合位點，NFAT5結(jié)合在其轉(zhuǎn)錄起始位點的上游186～199 bp的位置，從而促進MCP-1的表達。該研究結(jié)果顯示，胎盤組織中均有NFAT5與MCP-1的表達，且在早發(fā)型子癇前期患者胎盤組織中NFAT5與MCP-1的表達呈正相關(guān)；推測NFAT5可通過調(diào)節(jié)MCP-1的表達參與早發(fā)型子癇前期的發(fā)病過程，同時也提示MCP-1可能是NFAT5啟動活化的炎性因子之一。

研究[16]認為，早發(fā)型子癇前期孕婦的新生兒結(jié)局較差，主要因為早發(fā)型子癇前期與胎盤發(fā)育不良密切相關(guān)，在妊娠12～13周時，滋養(yǎng)細胞異常侵入子宮螺旋動脈，導(dǎo)致胎盤淺著床，最終造成高血壓、蛋白尿等癥狀，導(dǎo)致新生兒結(jié)局不良。該研究中作者發(fā)現(xiàn)，早發(fā)型重度子癇前期孕婦胎盤組織中NFAT5和MCP-1的表達均與新生兒體重及胎盤質(zhì)量呈負相關(guān)，可能原因是兩者共同作用引起滋養(yǎng)細胞凋亡，釋放的多種細胞因子透過胎盤屏障進入胎兒臍血內(nèi)，影響胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育，具體機制還有待進一步研究。

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(2016-07-04收稿 責任編輯姜春霞)

Expressions of NFAT5 and MCP-1 in patients with different types of preeclampsia placenta tissue

CUIShihong1),GAOYanan1),ZHANGLinlin2),LIULing1),WUJuan3),CHENJuan1),SHENLinna1),ZHIYunxiao1)

1)DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)PrenatalGeneEngineeringResearchCenterofHenanProvince,Zhengzhou450052 3)DepartmentofB-ultrasoundRoom,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

preeclampsia;NFAT5;MCP-1;perinatal outcome

Aim: To investigate the expressions of NFAT5 and MCP-1 and their relationship with the perinatal outcome in patients with severe preeclampsia. Methods: The expressions of NFAT5 and MCP-1 in 30 case of early-onset preeclampsia(EOPE group), 30 cases of late-onset preeclampsia(LOPE group) and 30 normal control (control group) tissue were detected by immunohistochemistry. RT-PCR was conducted to analyze the expressions of NFAT5 and MCP-1 mRNA in placental tissue. The relationship among the expressions of NFAT5 and MCP-1 protein and the perinatal outcome in EOPE group was analyzed.Results: NFAT5 and MCP-1 protein and mRNA expressions in the EOPE group were both higher than those in the LOPE group(P<0.05). However, there was no difference between the LOPE group and the control group(P>0.05).The expression of NFAT5 was positively correlated with the expression of MCP-1 in the EOPE group(r=0.779,P<0.001). NFAT5 and MCP-1 expressions in the EOPE group was negatively correlated with neonatal weight (r=-0.760，-0.560，P<0.05) and the placental weight(r=-0.583，-0.464，P<0.05).Conclusion: The expressions of NFAT5 and MCP-1 in the EOPE group are both higher than those in the LOPE group, which suggests that they may have different pathogenesis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.019

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目 201503109

R714.7