安宮牛黃丸對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

金玉珍，曹平

(重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院急救部ICU，重慶 402760)

安宮牛黃丸對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

金玉珍，曹平

(重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院急救部ICU，重慶 402760)

目的探討安宮牛黃丸對脂多糖引起的急性肺損傷的保護(hù)機(jī)制。方法將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(Control組，n=10)、脂多糖組(LPS組，n=10)、脂多糖+安宮牛黃丸組(LPS+AG組，n=10)和安宮牛黃丸組(AG組，n=10)。采用一次性腹腔注射脂多糖30 mg/kg建立大鼠急性肺損傷模型。分別檢測各組大鼠肺濕重/干重比、支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量、肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)水平。結(jié)果LPS+AG組肺組織SOD活性為(325.67±7.85)kU/g，明顯高于LPS組的(298.75±6.25)kU/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MDA、INF-α含量分別為(1.89±0.35)μmol/L、(35.21±3.12)ng/g，均低于LPS組的(2.78±0.41)μmol/L、(41.52±4.87)ng/g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LPS+AG組肺組織Nrf2蛋白表達(dá)為(0.87±0.19)，明顯高于LPS組的(0.34±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論安宮牛黃丸對脂多糖誘發(fā)的急性肺損傷具有保護(hù)作用，可能與其能激活肺組織Nrf2表達(dá)有關(guān)。

安宮牛黃丸；脂多糖；急性肺損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；腫瘤壞死因子α；轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是多種原因?qū)е碌某Ｒ娕R床綜合征，可以視為輕度的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，部分患者將會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重的ARDS，增加臨床救治難度，故ALI一直是基礎(chǔ)及臨床研究中的重點(diǎn)及難點(diǎn)[1]。膿毒癥誘導(dǎo)的ALI/ARDS臨床中十分常見，往往也是多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)發(fā)生的啟動(dòng)原因。既往已對ALI做了大量基礎(chǔ)及臨床研究，同時(shí)也采取了一系列的治療措施，但總體臨床救治效果仍不理想，死亡率仍較高，仍需進(jìn)一步研究完善[2-3]。祖國醫(yī)學(xué)對于危急重癥救治積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，也開發(fā)出了較多的經(jīng)過驗(yàn)證有效的中藥制劑。安宮牛黃丸是中醫(yī)危重病癥急救要藥之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用極其豐富，對多種疾病均有明確的救治療效。部分研究表明安宮牛黃丸對膿毒癥大鼠有多器官功能保護(hù)作用并能降低死亡率，其中肺保護(hù)作用是重要的一環(huán)，但對于安宮牛黃丸肺保護(hù)作用機(jī)制尚不完全明確[4]。近年來研究表明部分藥物對ALI的保護(hù)機(jī)制與轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信號通路密切相關(guān)[5-7]。本研究通過觀察安宮牛黃丸對脂多糖誘發(fā)的ALI的保護(hù)作用及其與肺組織內(nèi)Nrf2表達(dá)的關(guān)系，探索安宮牛黃丸緩解脂多糖性ALI的作用機(jī)制，為安宮牛黃丸的臨床應(yīng)用提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 安宮牛黃丸(生產(chǎn)批號111004，杭州市胡慶余堂有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG、Western blot檢測試劑盒購自美國Upstate Biotechnology公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體、Nrf2兔多克隆抗體、ABC試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作 40只清潔級Spragne-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(220±40)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，稱重后編號，按隨機(jī)數(shù)字表分為四組：對照組(Control組)，腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS液)；內(nèi)毒素組(LPS組)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖；內(nèi)毒素+安宮牛黃丸組(LPS+AG組)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖，同時(shí)造模前0.5 h和造模后6 h按2.0 g/kg劑量灌胃安宮牛黃丸；安宮牛黃丸組(AG組)，腹腔注射磷酸鹽緩沖液，注射前0.5 h和注射后6 h按2.0 g/kg劑量灌胃安宮牛黃丸。對照組、內(nèi)毒素組大鼠灌胃等容積蒸餾水。

1.3 肺濕重/干重測定 40只大鼠按上述處理，在脂多糖注射后48 h按頸椎脫臼法處死，剪開胸腔，暴露肺組織，取右肺中下葉稱取濕重(wet weight，W)，再置于80℃烤箱中24 h至重量恒定即干重(dry weight，D)。計(jì)算肺組織濕重/干重比值。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)蛋白濃度和白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計(jì)數(shù) 按規(guī)定時(shí)間處死大鼠后立即開胸取肺，切開右主支氣管，插入長約5 mm細(xì)塑料軟管，手術(shù)線加以固定，消毒血管鉗結(jié)扎左肺，用無菌生理鹽水灌洗右肺3次(每次3 mL)并回收灌洗液，最后回收到約7 mL BALF；用毛細(xì)玻璃管取80 μL，注入乙酸溶液中進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。將剩余的BALF以1 500 r/min離心15 min，取上清液置于-80℃冰箱保存，用于測定蛋白濃度。

1.5 肺組織中SOD和MDA測定 取大鼠左肺組織用預(yù)冷的生理鹽水在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，制備為10%組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照測試盒說明書測定SOD、MDA含量。

1.6 肺組織中TNF-α水平含量測定 取左肺組織用預(yù)冷的生理鹽水在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，制備為10%組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用雙抗體夾心ELISA法按試劑盒說明書要求操作，顯色后經(jīng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀數(shù)測定TNF-α蛋白含量。

1.7 Westen-bolt法檢測肺組織Nrf2表達(dá) Western blot檢測采用常規(guī)法進(jìn)行操作。取肺組織裂解30 min后，移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于-80℃保存；Lowry法測定總蛋白量。每孔加樣量為20 μg蛋白，將上樣緩沖液加入制備的樣本中，混勻，煮5 min，10 000 r/min離心10 min，等量上樣于7.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)。電泳畢，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDE膜，用新鮮配制的含3%脫酯奶粉的PBS液封閉；滴加Nrf-2一抗(抗體濃度1:1 000)過夜，次日應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體濃度1:2 000)孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法，X線片顯影。蛋白雜交條帶進(jìn)行相對密度掃描并分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析后兩兩比較行q檢驗(yàn)(Newman-Keuls法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺濕重/干重測定 與Control組比較，LPS組、LPS+AG組濕重/干重比值明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；LPS+AG組濕重/干重比值較LPS組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織濕重/干重比值情況(±s)

表1 各組大鼠肺組織濕重/干重比值情況(±s)

注：與Control組比較，aP＜0.05；與LPS組比較，bP＜0.05。

組別 只數(shù) 肺組織濕/干質(zhì)量比較Control組LPS組LPS+AG組AG組F值P值10 10 10 10 4.27±0.25 6.31±0.78a5.03±0.51ab4.02±0.22b43.15 0.000

2.2 BALF蛋白含量和白細(xì)胞計(jì)數(shù) LPS組48 h后大鼠BLAF蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)較Control組明顯增加(P＜0.05)；LPS+AG組大鼠BLAF蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)較LPS組明顯下降(P＜0.05)，AG組大鼠BLAF蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白含量變化(±s)

表2 肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白含量變化(±s)

注：與Control組比較，aP＜0.05；與LPS組比較，bP＜0.05。

組別 只數(shù) 蛋白含量(mg/L)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×107) Control組LPS組LPS+AG組AG組F值P值10 10 10 10 102.27±20.18 197.18±41.02a152.38±29.43ab106.25±21.45b125.48 0.000 4.12±0.29 7.32±0.48a5.03±0.33ab4.21±0.27b37.87 0.000

2.3 肺組織SOD活性和MDA、TNF-α含量測定 與Control組比較，LPS組48 h后大鼠肺組織SOD活性明顯降低(P＜0.05)，MDA、INF-α含量顯著升高(P＜0.05)；LPS+AG組SOD活性亦有降低，MDA、INF-α有升高，但較LPS明顯改善(P＜0.05)；AG組與Control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

2.4 肺組織Nrf2表達(dá) Control組肺組織Nrf2蛋白少量表達(dá)；LPS組48 h后大鼠肺組織Nrf2表達(dá)增強(qiáng)；LPS+AG組Nrf2表達(dá)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)；AG組Nrf2表達(dá)較Control組、LPS組明顯增強(qiáng)，見圖1。

圖1 肺組織Nrf2表達(dá)

3 討論

ALI/ARDS是臨床上常見的危重急癥，臨床上很多疾病都容易誘發(fā)內(nèi)毒素相關(guān)性ALI。脂多糖是內(nèi)毒素的主要成分之一，其進(jìn)入機(jī)體后將通過一系列變化導(dǎo)致ALI的發(fā)生發(fā)展，其中機(jī)體氧化還原失衡為重要原因。研究表明機(jī)體接觸刺激因子后啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，表現(xiàn)為消除化學(xué)物及機(jī)體內(nèi)過多的活性氧，阻止細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的發(fā)生來減輕損傷程度。近年來研究發(fā)現(xiàn)抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)酶的激活與Nrf2密切相關(guān)[8-9]。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者，在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到極其重要的保護(hù)作用。Papaiahgari等[10]發(fā)現(xiàn)博來霉素(BLM)處理后Nrf2-/-小鼠炎癥反應(yīng)、表皮細(xì)胞死亡情況及纖維化指標(biāo)均重于Nrf2+/+小鼠；BLM可引起Nrf2+/+小鼠體內(nèi)Nrf2表達(dá)及活性升高，抗氧化酶及II相解毒酶基因和蛋白水平上調(diào)，肺損傷和纖維化標(biāo)志物蛋白表達(dá)要比Nrf2-/-小鼠更低。Lyu等[11]發(fā)現(xiàn)基因敲除Nrf2可以加劇小鼠膿毒癥器官損害程度，增加死亡率。另有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2相關(guān)通路在吸煙誘發(fā)的肺氣腫和哮喘等疾病發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)重要作用[12]。部分藥物可通過促進(jìn)Nrf2表達(dá)減輕各種原因?qū)е碌腁LI，均提示Nrf2在細(xì)胞抗氧化反應(yīng)[13-14]。

安宮牛黃丸是祖國醫(yī)學(xué)發(fā)展過程中的瑰寶，是溫病“三寶”之一，具有清熱解毒、芳香辟穢、開竅通閉之功效，漫長的中醫(yī)發(fā)展過程中已證實(shí)對溫病有獨(dú)特的療效，歷來是中醫(yī)危重癥急救要藥之一。近年來國內(nèi)研究者應(yīng)用現(xiàn)代研究技術(shù)對安宮牛黃丸及其類方成藥治療膿毒癥進(jìn)行了一系列的研究。張丹等[4,15]將安宮牛黃丸應(yīng)用于嚴(yán)重腹腔感染的大鼠，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用安宮牛黃丸后，膿毒癥大鼠肺組織高遷移族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)基因表達(dá)較對照組明顯下降，肺組織MPO活性明顯降低。同時(shí)該組大鼠ALI程度明顯減輕，死亡率可有效下降。

根據(jù)安宮牛黃丸組方為基礎(chǔ)，應(yīng)用現(xiàn)代制藥技術(shù)研制而成的醒腦靜注射液是目前臨床上應(yīng)用較廣泛的中成藥針劑。胡丹丹等[16]在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)醒腦靜注射液可通過調(diào)節(jié)機(jī)體NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制重要的炎癥因子TNF-α表達(dá)減輕膿毒癥導(dǎo)致的大鼠心肌損傷，對心肌有明確的保護(hù)作用[16]。國內(nèi)學(xué)者在臨床研究中將醒腦凈注射液應(yīng)用于燒傷膿毒癥患者中，發(fā)現(xiàn)能抑制患者創(chuàng)面和血液中的細(xì)菌生長，減少菌血癥的發(fā)生；能有效拮抗炎性介質(zhì)及內(nèi)毒素的釋放，提高膿毒癥的救治療效，改善膿毒癥患者預(yù)后，進(jìn)一步證實(shí)了安宮牛黃丸在膿毒癥救治中有確切的療效[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠發(fā)生ALI時(shí)，大鼠肺組織中SOD活性降低，MDA含量增加，表明ALI時(shí)肺組織的氧化還原狀態(tài)平衡的確受到破壞，這與既往眾多研究結(jié)果一致。應(yīng)用安宮牛黃丸干預(yù)的大鼠肺組織MDA含量減少、SOD活性增加，提示安宮牛黃丸可部分恢復(fù)ALI時(shí)肺組織氧化還原平衡，減輕氧化應(yīng)激損害，從而減輕肺損傷的發(fā)生。ALI時(shí)因氧自由基大量釋放，超出機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除能力，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂肪酸鏈斷裂使膜通透性增加，使氣血屏障的完整性被破壞及肺泡壁通透性增加等原因?qū)е路嗡黠@增加，本研究中表現(xiàn)為LPS組大鼠肺濕重/干重明顯大于對照組。而安宮牛黃丸干預(yù)后大鼠肺濕重/干重較LPS組明顯降低，提示安宮牛黃丸可顯著減少大鼠肺水的產(chǎn)生，改善氧合情況，減輕肺損傷的程度。本研究中還發(fā)現(xiàn)LPS可增加肺組織Nrf2表達(dá)，考慮與LPS能激活機(jī)體氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)，也說明Nrf2可能參與了機(jī)體保護(hù)作用。而LPS+安宮牛黃丸組及單純安宮牛黃丸組Nrf2表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示其可能通過激活肺組織Nrf2表達(dá)來抑制LPS誘發(fā)的ALI程度。

本研究結(jié)果顯示安宮牛黃丸可有效抑制脂多糖誘發(fā)的急性肺損傷，這種保護(hù)性作用可能與安宮牛黃丸激活肺組織Nrf2表達(dá)，部分恢復(fù)機(jī)體氧化/抗氧化平衡有關(guān)。但安宮牛黃丸在膿毒癥救治中是否有量效關(guān)系，是否存在其他不同及機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究明確。

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Effects of Angong Niuhuang Wan on expression of Nrf2 protein in lung tissue of rats with LPS-induced acute lung injury

JIN Yu-zhen,CAO Ping.Department of Critical Care Medical,Bi'shan District People's Hospital of Chongqing,Chongqing 402760,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of Angong Niuhuang Wan(AG)on lipopolysaccharide-induced(LPS-induced)acute lung injury(ALI)in rats.MethodsFourty rats were randomly divided into four groups:control group(n=10),LPS group(n=10),LPS+AG group(n=10)and AG group(n=10).The ALI rat models were established by intraperitoneal injection of LPS 30 mg/kg.The lung wet/dry weight ratio,total protein concentration and WBC count in brochoalveolar lavage fluid(BALF),lung tissue superoxide dismutase(SOD)activity,malonaldehyde(MDA)and tumor necrosis factor α(TNF-α)content,lung tissue nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)levels were respectively examinated among the four groups.ResultsThe SOD activity in lung tissue of LPS+ AG group was(325.67±7.85)kU/g,which was significantly higher than that of LPS group of(298.75±6.25)kU/g,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The content of MDA and INF-α of LPS+AG group were respectively (1.89±0.35)μmol/L and(35.21±3.12)ng/g,which were significantly lower than(2.78±0.41)μmol/L,(41.52±4.87)ng/g of LPS group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of Nrf2 protein in lung tissue of LPS+AG group was(0.87±0.19),which was significantly higher than that of LPS group(0.34±0.11),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionAngong Niuhuang Wan has protective effects on LPS-induced ALI, and it may be related to the activation of Nrf2 expression in lung tissue.

Angong Niuhuang Wan(AG);Lipopolysaccharide(LPS);Acute lung injury(ALI);Superoxide dismutase(SOD);Malondialdehyde(MDA);Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α);Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)

R-332

A

1003—6350（2017）05—0689—04

2016-09-01)

重慶市衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(編號：2016MSXM180)

曹平。E-mail：zzjeicu@yeah.net

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.001