HPLC法對賀蘭山東麓干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的測定與分析

孫佳瑩，劉娟，王宏，張軍翔*

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 銀川市氣象局，銀川 750002；3. 寧夏米擒酒莊，銀川 750021；4. 寧夏葡萄與葡萄酒研究院/寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，銀川 750021）

HPLC法對賀蘭山東麓干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的測定與分析

孫佳瑩1，劉娟2，王宏3，張軍翔4*

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 銀川市氣象局，銀川 750002；3. 寧夏米擒酒莊，銀川 750021；4. 寧夏葡萄與葡萄酒研究院/寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，銀川 750021）

本文利用高效液相色譜法（HPLC）測定賀蘭山東麓干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)。為了確定最佳檢測條件，首先對色譜檢測條件的色譜柱、流動相和洗脫程序進(jìn)行了對比選擇。利用最佳的HPLC分析方法對黑比諾、西拉、蛇龍珠、美樂和赤霞珠5種葡萄酒中的酚類物質(zhì)進(jìn)行了測定，得出單體酚總量最大的是美樂，為794.99 mg/L；最少的是黑比諾，為355.27mg/L?；ㄉ辗涌偭孔畲蟮氖巧啐堉?，為413.59 mg/L；最少的是也黑比諾，為213.61 mg/L，且在黑比諾葡萄酒中花青素單葡萄糖苷并未被檢測到。由此可見，不同品種葡萄酒中酚類物質(zhì)的種類和含量具有較大的差異，因此利用HPLC測定方法可以進(jìn)行不同葡萄酒品種的鑒定。

高效液相色譜；干紅葡萄酒；酚類物質(zhì)；賀蘭山東麓

隨著葡萄酒產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，我國葡萄酒的生產(chǎn)和消費(fèi)水平也呈現(xiàn)快速增長趨勢。因葡萄酒中的酚類物質(zhì)具有一定的營養(yǎng)和保健價(jià)值，已然成為人們喜愛的健康飲品之一。根據(jù)其顏色的不同，可把葡萄酒中的多酚類物質(zhì)分為無色多酚和有色多酚兩大類，無色多酚物質(zhì)主要包括單寧和酚酸等單體酚，其中酚酸類化合物多數(shù)為對羥基苯甲酸和對羥基苯丙烯酸（肉桂酸）的衍生物[1]，如沒食子酸、水楊酸、安息香酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等，有色多酚物質(zhì)主要包括黃酮類和花色苷類，葡萄酒中常見的花色苷有花翠素單葡萄糖苷、花青素單葡萄糖苷、甲基花翠素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷、二甲花翠素單葡萄糖苷、甲基花青素乙酰化葡萄糖苷、二甲花翠素乙?；咸烟擒铡⒓谆ㄇ嗨叵愣辊；咸烟擒铡⒍谆ù渌叵愣辊；咸烟擒盏?。這些酚類化合物是葡萄酒重要的組成成分，它們構(gòu)成了葡萄酒的“骨架”，賦予了葡萄酒獨(dú)特的顏色、口感、氣味等感官特征，所以建立一種快速高效檢測葡萄酒中酚類物質(zhì)的分析方法具有重要意義[2]。

高效液相色譜法（HPLC）是檢測葡萄酒中酚類化合物的常用方法之一，具有分離效果好、準(zhǔn)確性高、分析速度快以及儀器自動化程度高等特點(diǎn)，該方法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于不同葡萄酒酚類物質(zhì)含量的分析研究中[3-6]。本文以寧夏賀蘭山東麓干紅葡萄酒為樣品，主要在色譜柱、流動相和洗脫程序上對HPLC測定葡萄酒中酚類物質(zhì)的方法進(jìn)行了對比選擇，并用最佳方法對供試葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行了定量測定，探討不同品種干紅葡萄酒中酚類物質(zhì)的構(gòu)成特點(diǎn)及含量差異性，為后期研究與利用HPLC法測定葡萄酒中的酚類物質(zhì)提供理論參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品：供試5個(gè)紅葡萄酒樣（赤霞珠，美樂，蛇龍珠，黑比諾和西拉），均以2013年寧夏銀川產(chǎn)區(qū)葡萄為原料，采用傳統(tǒng)工藝釀制后瓶儲、陳釀，由寧夏西夏王有限公司釀制。

單體酚標(biāo)準(zhǔn)品：水楊酸（salicylic acid）、安息香酸（benzoic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、沒食子酸（gallic acid），購于美國Sigma公司。

花色苷標(biāo)準(zhǔn)品：二甲花翠素單葡萄糖苷，購于美國Sigma公司。

試劑：甲酸、乙酸、乙酸乙酯均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，購于銀川為民生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52AA，上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜檢測儀器為Agilent 1100；色譜柱：Ultra Ⅱ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm，美國瑞斯泰克公司）、TSKgel ODS-100V（250 mm×4.6 mm×5 μm，美國安捷倫公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單體酚的測定方法篩選[7]

酒樣前處理：用20 mL乙酸乙酯分別萃取20 mL葡萄酒樣3次，合并有機(jī)相后減壓蒸餾濃縮至干（＜37 ℃），以4 mL色譜甲醇溶解殘?jiān)?，?30 ℃左右下避光儲存，待液相檢測分析，在分析測定前需使用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾處理后的樣品。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別稱取10 mg沒食子酸、安息香酸、咖啡酸、水楊酸，溶解于色譜甲醇中并定容至10 mL，作為母液備用。將此溶液稀釋成7個(gè)不同濃度梯度（7.8～500 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在-30 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC分析方法：流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣體積：10 μL，具體方法見表1。

1.3.2 花色苷的測定方法篩選

酒樣前處理：0.45 μm水系濾膜過濾酒樣后，待測。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱取1 mg二甲花翠素單葡萄糖苷標(biāo)品，溶解于1%鹽酸甲醇溶液并定容至10 mL，將此溶液稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)液，進(jìn)樣分析。

HPLC分析方法：流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：535 nm；進(jìn)樣體積：10 μL，具體方法見表2。根據(jù)α及吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品對照定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

表1 單體酚的三種不同HPLC分析條件

表2 花色苷的三種不同HPLC分析條件

2 結(jié)果與分析

2.1 單體酚的測定2.1.1 單體酚HPLC分析方法的選擇

每種分析方法的分離結(jié)果如表3和圖1所示。

由表3可以看出，方法3中4種單體酚在標(biāo)準(zhǔn)品中的保留時(shí)間最短，方法1次之，方法2最長；此外，對比圖1中的方法1與方法2色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，方法2中安息香酸沒有得到較好地分離，且出現(xiàn)的雜峰較多，出峰時(shí)間漂移，不穩(wěn)定，分離效果較方法1差；再對比方法1與方法3色譜圖可以看出，方法1中出現(xiàn)的雜峰比方法3的多，且出峰時(shí)間沒有方法3的穩(wěn)定，分離效果較方法3差。綜上所述，方法3分離出4種單體酚所用時(shí)間最短，且分離酒樣的效果也是最好的，所以可以確定為測定葡萄酒中單體酚的最佳HPLC分析方法。

表3 不同方法1000 mg/L混標(biāo)溶液中四種單體酚保留時(shí)間 （min）

圖1 3種方法赤霞珠葡萄酒樣HPLC色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

利用最佳HPLC方法對不同濃度梯度的單體酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相分析，以質(zhì)量濃度Y為縱坐標(biāo)，峰面積X為橫坐標(biāo)，計(jì)算得出4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表4。每種無色多酚標(biāo)樣的R2都在0.999以上，可知這4種單體酚標(biāo)品溶液的含量和檢測響應(yīng)值間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表4 4種單體酚的回歸方程

2.1.3 葡萄酒樣中單體酚的定性定量分析

利用最佳HPLC分析方法對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)5種不同葡萄酒進(jìn)行測定后得到以赤霞珠為例的HPLC色譜圖，由標(biāo)品的保留時(shí)間和峰值特征得出4種單體酚在酒樣中的相應(yīng)色譜峰，如圖1中方法3所示。

已知4種單體酚的線性回歸方程，將5種葡萄酒樣品所對應(yīng)的各個(gè)單體酚的峰面積分別代入方程后得出寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)不同品種葡萄酒的單體酚含量，如表5所示。

由表5可以看出，該產(chǎn)區(qū)5個(gè)不同品種紅酒中，4種單體酚在葡萄酒中的含量相差較大。黑比諾葡萄酒中單體酚含量由大到小為：沒食子酸＞咖啡酸＞水楊酸＞安息香酸；其他葡萄酒樣均為：沒食子酸＞水楊酸＞咖啡酸＞安息香酸，其中沒食子酸的含量是最高的，在美樂中高達(dá)572.10 mg/L，黑比諾中最低，為150.64 mg/L，不到美樂的1/3。黑比諾與赤霞珠中的水楊酸含量相近，蛇龍珠的水楊酸含量最高，為141.95 mg/L，約為黑比諾的3倍；安息香酸在每種酒樣間的含量差距不大；咖啡酸在赤霞珠中的含量最低為42.06 mg/L，西拉和蛇龍珠的咖啡酸含量相差不大，含量最高的是黑比諾，為122.79 mg/L，約為赤霞珠的3倍。單體酚總含量由大到小依次為：美樂＞蛇龍珠＞赤霞珠＞西拉＞黑比諾，其中，西拉和赤霞珠總量較接近，相差不大，其他酒樣間總量相差較大。

表5 寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)紅葡萄酒單體酚含量 （mg/L）

2.2 花色苷的測定

2.2.1 花色苷HPLC分析方法的對比選擇

每種分析方法的分離結(jié)果分別如圖2所示。

對比圖2中的方法1與方法2色譜圖可以看出，方法2中出現(xiàn)的雜峰比方法1多，且出峰時(shí)間漂移，不穩(wěn)定，圖中花翠素單葡萄糖苷與花青素單葡萄糖苷沒有得到較好的分離，再對比方法1與方法3色譜圖，發(fā)現(xiàn)方法3的出峰時(shí)間較穩(wěn)定，整體的分離效果較好。所以，方法3的出峰時(shí)間最穩(wěn)定，整體分離效果最好，可以確定為測定葡萄酒中花色苷酚的最佳HPLC分析方法。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

利用最佳HPLC方法對不同濃度梯度的二甲花翠素單葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相分析，以質(zhì)量濃度Y為縱坐標(biāo)，峰面積X為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到二甲花翠素單葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.0510x-0.6148，R2為0.9995，相關(guān)性良好。

圖2 3種方法美樂葡萄酒樣HPLC色譜圖

圖3 赤霞珠葡萄酒花色苷HPLC色譜圖

2.2.3 葡萄酒樣花色苷的定性分析

依據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法計(jì)算花色苷的相對保留時(shí)間，公式為：α=tn/trs，式中tn：待測峰絕對保留時(shí)間，trs：參考峰的絕對保留時(shí)間，且參考峰選擇面積較大、保留時(shí)間居中的峰。本試驗(yàn)選擇（14.41±0.15）min保留時(shí)間的二甲花翠素單葡萄糖苷標(biāo)品作為參考峰，根據(jù)文獻(xiàn)[12-16]確定葡萄酒樣品中花色苷的名稱及出峰順序，結(jié)果如圖3（以赤霞珠為圖例）和表6所示。

表6 花色苷色譜峰鑒定表

表7 賀蘭山東麓紅葡萄酒花色苷含量 （mg/L）

運(yùn)用本試驗(yàn)最終確定的HPLC分析方法對供試樣品花色苷進(jìn)行分析測定后，通過相對保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定出葡萄酒中含量最大的9種花色苷，結(jié)果如表6所示。

2.2.4 葡萄酒樣花色苷的含量分析

對5種不同葡萄酒花色苷的檢測結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，得到供試酒樣的花色苷含量（以二甲花翠素單葡萄糖苷計(jì)），結(jié)果如表7所示。

從表7可以看出，供試的5個(gè)不同酒樣中黑比諾葡萄酒的9種花色苷總量均低于其他酒樣，為213.61 mg/L，而蛇龍珠葡萄酒總含量最高為413.59 mg/L；9種花色苷中Mv-3-Glu是所有酒樣含量最大的花色苷，在147.09～243.14 mg/L之間，可占花色苷總量的56.89%左右，不同葡萄酒中Mv-3-Glu的含量由小到大依次為：黑比諾＜美樂＜西拉＜赤霞珠＜蛇龍珠；Mv-3-Acglu在葡萄酒中的含量排第二，在25.05～69.76 mg/L之間；Cy-3-Glu和Pn-3-Couglu在所有葡萄酒中的含量最少，除西拉葡萄酒的Pn-3-Couglu含量超過了10 mg/L外，其他葡萄酒Cy-3-Glu和Pn-3-Couglu含量均沒有超過10 mg/L，但是，在黑比諾葡萄酒中未檢測到花青素單葡萄糖苷（Cy-3-Glu）。

3 結(jié)論與討論

通過色譜柱、流動相和洗脫程序的篩選，得出HPLC分析的最佳試驗(yàn)條件，并在該條件下對寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)5種不同品種葡萄酒中的酚類物質(zhì)進(jìn)行了測定，得出不同品種葡萄酒中單體酚總含量最高的是美樂（794.99 mg/L），最少的是黑比諾（355.27 mg/L）；花色苷總含量最高的是蛇龍珠（413.59 mg/L），最少的是也黑比諾（213.61 mg/L），且在黑比諾葡萄酒中花青素單葡萄糖苷并未被檢測到，利用這一特征可以區(qū)別黑比諾與其他葡萄酒。此結(jié)果說明，同一產(chǎn)區(qū)不同品種葡萄酒的酚類物質(zhì)含量不同，且每種酚類物質(zhì)含量也大不相同，都存在較大的差異，說明酚類物質(zhì)含量與葡萄的品種特點(diǎn)、產(chǎn)區(qū)環(huán)境條件、栽培管理方式、釀造工藝等因素有關(guān)；Jennifer[12]曾指出，赤霞珠葡萄酒中Mv-3-Acglu和Mv-3-Couglu比率大于3，以此可以判斷赤霞珠葡萄品種的典型特征，在本試驗(yàn)中這一特征也得到了驗(yàn)證，即赤霞珠酒樣中的這兩種花色苷比率大于3。

本試驗(yàn)只研究了產(chǎn)區(qū)內(nèi)部分品種及種類葡萄酒的酚類物質(zhì)，擬在今后的試驗(yàn)中，對多種葡萄酒的多種酚類物質(zhì)作更多的測定研究，以期全面了解分析寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒酚類物質(zhì)的構(gòu)成特點(diǎn)和含量差異，為后期研究提供更多的理論參考。

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Determination and analyse of phenols in dry red wine from the eastern foot of Helan mountain by HPLC

SUN Jiaying1, LIU Juan2, WANG Hong3, ZHANG Junxiang4*
(1. School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan, Ningxia 750021, China; 2. Yinchuan Weather Bureau, Yinchuan, Ningxia 750002, China; 3. MiQin Winery of Ningxia, Yinchuan, Ningxia 750021, China; 4. Ningxia Institute of Grape and Wine, Wine Scool of Ningxia University, Yinchuan, Ningxia 750021, China)

The phenols in dry red wine from the eastern foot of Helan mountain were determined by high performance liquid chromatography(HPLC). In order to ensure the best detection conditions, the chromatographic detection conditions, including chromatographic column, mobile phase, elution program were compared and optimized, the best HPLC conditions were choosed to determine the content of phenols in 5 kinds of different wine such as Pinot Noir, Shirz, Cabernet Gernischt, Merlot, Cabernet Sauvignon, they all were from the eastern foot of Helan mountain. The results showed that the largest content of mono-phenols was in Merlot wine for 794.99 mg/L, the lowest content of mono-phenols was in Pinot Noir wine for 355.27 mg/L; and the largest content of anthocyanins was in Cabernet Gernischt wine for 413.59 mg/L, the lowest content of anthocyanins was in Pinot Noir also. So there were a great difference in phenolics content and kinds between different varieties.

HPLC; dry red wine; phenols; the eastern foot of Helan mountain

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.02.006

2017-01-20

2013年度國家自然科學(xué)地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：31260392）；銀川市西夏區(qū)研究開發(fā)項(xiàng)目

孫佳瑩（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒。E-mail: 972461157@qq.com

*通訊作者：張軍翔（1971-），男，博士，教授，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒。E-mail: zhangjunxiang@126.com