降解菌株的篩選及其對聚丁二酸丁二醇酯薄膜的降解

丁子洋，于博文，王 碩，齊佳慧，王曉玲，王戰(zhàn)勇

（遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧撫順113001）

塑料與環(huán)境

降解菌株的篩選及其對聚丁二酸丁二醇酯薄膜的降解

丁子洋，于博文，王 碩，齊佳慧，王曉玲，王戰(zhàn)勇*

（遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧撫順113001）

從活性污泥中篩選得到1株具有聚丁二酸丁二醇酯（PBS）降解能力的菌株LSU1601，經(jīng)菌體形態(tài)特征、菌落培養(yǎng)特征、生理生化鑒定和16S rDNA基因序列分析，初步鑒定為德氏食酸菌（Acidovorax delafiedii）。結(jié)果表明，菌株LSU1601在培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)基起始p H值為6.8、培養(yǎng)時間為48 h以及振蕩轉(zhuǎn)速為120 r/min的條件下，具有較高的產(chǎn)PBS降解酶的能力；同時菌株在培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基起始p H值為6.8的條件下，經(jīng)84 h的培養(yǎng)，對PBS薄膜的降解率可達到48.2%；經(jīng)微生物降解作用，PBS薄膜表面出現(xiàn)明顯侵蝕痕跡，且隨著降解時間的增加，侵蝕作用更加明顯；PBS經(jīng)微生物降解產(chǎn)生了1，4丁二醇單體、1，4-丁二酸單體以及丁二酸-丁二醇二聚體，未發(fā)現(xiàn)其他的寡聚體。

聚丁二酸丁二醇酯；降解；德氏食酸菌

0 前言

隨著科技的進步及全球人口的劇增，石油基高分子材料消費不斷增加，導(dǎo)致石油資源的匱乏以及一系列的環(huán)境污染問題。這使得研發(fā)出既具有石油基高分子材料的良好理化性能，又易于降解且終端降解產(chǎn)物對環(huán)境無危害的生物可降解酯成為相關(guān)研究的熱點。其中，PBS作為一種重要的可生物降解高分子材料更是備受矚目［1］。除了具有生物降解性能外，PBS還具有良好的力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性和加工性能，同時還具有較穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，易于儲存和使用等優(yōu)點［2］。

PBS的重要特性就是生物降解性。目前，對于PBS生物降解性的研究主要包括土壤堆肥降解、微生物降解及生物酶（一般是酯酶或角質(zhì)酶）降解等。Wu等［3］研究了堆肥條件下PBS薄膜的降解，發(fā)現(xiàn)隨著堆肥時間的推移，PBS薄膜表面出現(xiàn)裂紋和孔洞且逐漸變多變大，剩余PBS的質(zhì)量和相對分子質(zhì)量持續(xù)下降。白俊巖等［4］篩選得到的門多薩假單胞菌PBS1302對PBS薄膜降解，薄膜降解后有片層剝落的現(xiàn)象。Mao等［5］使用鐮刀霉FS1301對PBS薄膜進行降解，發(fā)現(xiàn)隨著降解的不斷進行，微生物不斷侵蝕PBS薄膜表面，并在PBS薄膜上形成孔洞，PBS的熱穩(wěn)定性、結(jié)晶度及熔點減小。Aamer等［6］在菌株Roseateles depolymerans TB-87中提取得到的降解酶Est-H和Est-L可將PBS水解為所對應(yīng)的單體或短鏈的低聚物。

本文從活性污泥中篩選得到一株具有PBS降解能力的菌株——德氏食酸菌，研究了菌株對PBS薄膜的降解特性，有助于了解PBS的生物降解機理，為利用菌株及其降解酶進行以PBS為代表的生物可降解塑料廢棄物的后續(xù)處理及利用奠定了研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要原料

PBS，重均相對分子質(zhì)量為1.5×104～2.1×104，酸醇比為1.1∶1，安徽安慶和興化工有限責(zé)任公司；

氯化銨（NH4Cl）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、氯仿，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

瓊脂，生物純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；

十二烷基磺酸鈉，分析純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；

PBS乳化液，將0.3 g的PBS溶于10 mL氯仿，加入10 mg的十二烷基磺酸鈉后再加入200 mL無機鹽培養(yǎng)基混合均勻，經(jīng)超聲波處理后，除去氯仿并定容至200 mL，即得PBS乳化液（0.15%，w/v）；

無機鹽培養(yǎng)基（w/v），0.1%的NH4Cl、0.05%的MgSO4·7H2O、0.0005%的CaCl2·2H2O、0.554%的KH2PO4和1.194%的Na2HPO4·12H2O［5］；

PBS液體培養(yǎng)基（w/v），無機鹽培養(yǎng)基添加0.15%的PBS粉末；

PBS固體培養(yǎng)基（w/v），PBS液體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂。

1.2 主要設(shè)備及儀器

電子天平，AR124CN，奧豪斯儀器（上海）有限公司；

酸度計，F(xiàn)E20 Five Easy Plus，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱，DNP-9052，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

生物潔凈工作臺，BCN-1360B，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械有限公司；

恒溫培養(yǎng)振蕩器，ZDP-250，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

超聲波細胞粉碎機，JY92-IIDN，寧波新芝生物科技股份有限公司；

平板硫化機，TSE-18A，江蘇省江陰市文林化工機械廠；

掃描電子顯微鏡（SEM），XL30ESEM FEG，荷蘭FEI公司；

高效液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS），Waters Alliance 2695/ZQ 4000，美國Waters公司。

1.3 樣品制備

PBS降解菌株的篩選及鑒定：從撫順石油化工公司石油三廠水凈化車間采集活性污泥，取1 mL的活性污泥加入100 m L的PBS液體培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)并定期觀察，待發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁且其中PBS粉末明顯減少后，取培養(yǎng)液進行梯度稀釋，涂布于PBS固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取生長狀況良好且能夠形成明顯水解透明圈的單菌落進行保存；將上述選定的菌株接種于PBS液體培養(yǎng)基中，30℃下，以150 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48 h后再以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min；取1 mL離心上清液加入3 mL的PBS乳化液中，40℃下保溫，每隔10 min測定一次吸光度值（A630nm），計算吸光度值的變化（ΔA630nm），判斷菌株對PBS的降解能力；

依據(jù)參考文獻［7］對菌株的生長情況、菌落的生長特征、菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色反應(yīng)及生理生化反應(yīng)進行鑒定；菌株的16S rDNA序列測序工作由北京鼎國生物技術(shù)有限公司完成；

培養(yǎng)條件對菌株降解PBS的影響：將選育得到的降解菌株接種于裝有100 mL PBS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，以培養(yǎng)液中由菌株產(chǎn)生的PBS降解酶活力為指標(biāo)考察培養(yǎng)條件對菌株降解PBS的影響，研究考察了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基p H值以及振蕩轉(zhuǎn)速對菌株降解PBS能力的影響；培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取1 mL上清液加入到3 mL的PBS乳化液中，迅速混勻，測量其反應(yīng)初始時的吸光度值（A1），40℃下保溫20 min，測量反應(yīng)結(jié)束時的吸光度值（A2）；酶活力單位定義為一個酶活力單位（U）為每分鐘引起光吸收值降低0.001所需的酶量，計算公式如式（1）所示。

式中 U——酶活力，mL

A1——反應(yīng)初始時的吸光度值

A2——反應(yīng)結(jié)束時的吸光度值

T——反應(yīng)時間，min

V——粗酶液體積，mL

菌株對PBS薄膜的降解：將PBS置于180℃的平板硫化機上預(yù)熱2 min，保壓2 min（50 kg/cm2）后排氣20次，熱壓10 min后冷壓10 min，冷卻至室溫，獲得厚度約為0.5 mm的PBS薄膜，將其裁剪為3 cm×1 cm的樣條，80℃下真空干燥至恒重，待用；將上述PBS薄膜加入無機鹽培養(yǎng)基（p H＝6.8），并接入PBS降解菌株，30℃下，以120 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，定期取出PBS薄膜；去離子水清洗后，干燥至恒重，稱量計算菌株對PBS薄膜的降解率；以未接入降解菌株的無機鹽培養(yǎng)基作為對照組，相同條件下培養(yǎng)并計算薄膜的降解率［式（2）］。

式中 R——薄膜的降解率，%

m0——降解前共混材料樣品薄膜的質(zhì)量，g

m1——降解后共混材料樣品薄膜的質(zhì)量，g

1.4 性能測試與結(jié)構(gòu)表征

SEM分析：采用SEM觀察菌株降解前后的PBS薄膜，加速電壓為20 k V；

LC-MS分析：培養(yǎng)液經(jīng)12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，使用截留相對分子質(zhì)量為3000 D的超濾離心管處理除去蛋白等大分子，離子源為ESI，正負電離模式同時掃描，毛細管電壓為3.5 k V，錐孔電壓為20 V，RF透鏡的電壓為0.5 V，源溫為120℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBS降解菌株的篩選

選育得到3株具有PBS降解能力的菌株，分別編號為LSU1601、LSU1602及LSU1603。在PBS液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后離心，取上清液加入PBS乳化液中于40℃下保溫，測定A630nm的變化情況。由圖1可以看出，菌株LSU1601的發(fā)酵上清液與PBS乳化液混合孵育后其ΔA630nm值最大，而菌株LSU1602和LSU1603的ΔA630nm則相對較低。說明3株菌株均具有對PBS的降解能力，但相同條件下LSU1601菌株對PBS的降解能力更強，表明菌株LSU1601分泌到發(fā)酵液中的PBS降解酶的活力最高。判定菌株LSU1601具有較好的PBS降解能力，因此選擇菌株LSU1601作為研究對象進行后續(xù)研究。

圖1 菌株對PBS的降解能力Fig.1 Degradation activity of strains on PBS

2.2 菌株LSU1601的鑒定

菌株LSU1601的單一菌落呈現(xiàn)圓形、淺黃色、中間凸起、表面光滑無皺紋。菌株為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢。菌株LSU1601的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株LSU1601的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab.1 The physiological and bio-chemical characteristics of strain LSU1601

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對菌株LSU1601的16S rDNA序列進行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株LSU1601與進行比較的大多數(shù)德氏食酸菌菌株的16S rDNA序列同源性在99%以上，因此在系統(tǒng)進化上十分接近。結(jié)合表1的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果，依據(jù)Bergey（1994）分類系統(tǒng)，初步鑒定菌株LSU1601屬于德氏食酸菌。

2.3 培養(yǎng)條件對菌株LSU1601降解PBS的影響

圖2 培養(yǎng)條件對菌株LSU1601降解PBS的影響Fig.2 The effect of culture conditions on PBS degradation by LSU1601 strain

圖2（a）所示為培養(yǎng)時間對菌株LSU1601產(chǎn)生PBS降解酶能力的影響，菌株產(chǎn)生PBS降解酶的能力受培養(yǎng)時間影響較大。0～48 h階段隨著培養(yǎng)時間的增長，發(fā)酵液酶活力呈升高的趨勢，此后繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，酶活力反而呈下降的趨勢。圖2（b）所示為培養(yǎng)溫度對菌株LSU1601產(chǎn)生PBS降解酶能力的影響。可以看出，溫度對菌株產(chǎn)酶能力影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而在培養(yǎng)溫度為30℃時有最高的產(chǎn)酶活力。培養(yǎng)初始p H對菌株LSU1601產(chǎn)PBS降解酶的影響如圖2（c）所示。菌株產(chǎn)PBS降解酶能力隨著初始培養(yǎng)p H值的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)初始培養(yǎng)p H為6.8時具有最高的酶活力。如圖2（d）所示為振蕩轉(zhuǎn)速對菌株LSU1601產(chǎn)PBS降解酶的影響。當(dāng)振蕩轉(zhuǎn)速為120 r/min時，菌株LSU1601具有較高的產(chǎn)酶能力，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于120 r/min后，菌株產(chǎn)生降解酶的能力反而有下降的趨勢。

2.4 菌株LSU1601對PBS薄膜降解過程分析

從圖3可以看出，未接入降解菌的對照組薄膜經(jīng)84 h的培養(yǎng)也有降解現(xiàn)象發(fā)生（降解率＜2%），這與PBS的自身水解有一定的關(guān)系。而菌株LSU1601對PBS薄膜的降解與對照組相比更為明顯，說明菌株的確對PBS具有降解作用。菌株LSU1601對PBS降解的過程大致可以分為2個階段：快速降解階段（0～48 h），此階段PBS薄膜的降解率持續(xù)迅速上升。在經(jīng)菌株降解48 h后，PBS薄膜的降解率達到44.5%。微生物在此階段大量繁殖，并分泌降解酶利用PBS，因此薄膜失重較快；緩慢降解階段（48～84 h），此階段薄膜的降解率略有上升但增幅較小，經(jīng)菌株84 h的降解，降解率為48.2%。緩慢降解階段的出現(xiàn)應(yīng)該與酸性降解產(chǎn)物在體系中的積累有關(guān)（這一點在后續(xù)的降解產(chǎn)物分析中得到證實），酸性降解產(chǎn)物的出現(xiàn)改變了環(huán)境p H，進而影響了菌體生長導(dǎo)致降解率增幅緩慢。

圖3 菌株LSU1601對PBS薄膜的降解曲線Fig.3 Degradation curve of PBS film degraded by LSU1601 strain

2.5 PBS薄膜經(jīng)菌株LSU1601降解后的SEM分析

如圖4所示，未經(jīng)微生物降解的PBS薄膜表面光滑平整，具有規(guī)則的紋路。隨著降解時間的增加可以看出，在菌株LSU1601的作用下，PBS薄膜表面開始變粗糙，出現(xiàn)明顯的侵蝕痕跡。隨著降解時間的進一步延長，PBS薄膜表面的侵蝕加劇，開始出現(xiàn)較大孔洞，且孔洞隨時間有進一步增大的趨勢。

圖4 PBS薄膜經(jīng)菌株LSU1601降解后的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM of PBS films degraded by LSU1601 strain

2.6 菌株LSU1601降解PBS生成降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

如圖5所示，在89.1、116.9、188.9位置出現(xiàn)的吸收峰分別對應(yīng)于1，4丁二醇、1，4-丁二酸和丁二酸-丁二醇。這些化合物在原培養(yǎng)基組分中并不存在，說明這些化合物是由于PBS被降解而新生成的，進一步證明了菌株對PBS的降解作用。Mao等［5］曾利用Fusarium sp.FS1301對PBS薄膜進行降解，在降解產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了三聚體（丁二酸-丁二醇-丁二酸）和四聚體（丁二酸-丁二醇-丁二酸-丁二醇），而菌株LSU1601的降解產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)這些寡聚體，這說明不同微生物對PBS的降解機理不同，這應(yīng)該與降解酶的性質(zhì)是密切相關(guān)的。

圖5 PBS降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.5 MS of degradation products of PBS

3 結(jié)論

（1）從活性污泥中篩選得到一株具有PBS降解能力的菌株LSU1601，初步鑒定其屬于德氏食酸菌；

（2）菌株LSU1601在培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)基起始p H＝6.8的條件下，經(jīng)84 h的培養(yǎng)，對PBS薄膜的降解率可達到48.2%；經(jīng)微生物降解作用的PBS薄膜表面出現(xiàn)明顯侵蝕痕跡，而且隨著降解時間的增加，這種侵蝕作用更加明顯，甚至出現(xiàn)坑洞；

（3）PBS經(jīng)菌株LSU1601降解產(chǎn)生了1，4丁二醇單體、1，4-丁二酸單體以及丁二酸-丁二醇二聚體，未發(fā)現(xiàn)其他的寡聚體。

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Screening of Degrading Strain and Its Degradation on Poly（butylenes succinate）Films

DING Ziyang，YU Bowen，WANG Shuo，QI Jiahui，WANG Xiaoling，WANG Zhanyong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Environmental Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun 113001，China）

A strain，LSU1601，with a degradation activity for poly（butylenes succinate）（PBS）was isolated from activated sludge.The strain was identified as Acidovorax delafiedii by thallus morphology analysis，colonies characterization，physiological reaction，biochemical reaction and 16S rDNA analysis.This strain exhibited a high production capability for PBS-degrading enzymes when the cultivation temperature was set to 30℃，the initial acidity was set to p H 6.8，the cultivation time was set to 48 h，and the shaking speed was set to 120 r/min.The percentage of biodegradation reached 48.2%when the cultivatable time was 84 h，the cultivatable temperature was 30℃，and the initial acidity of culture medium was p H 6.8.The electron microscopic observation of the degraded PBS films showed that the film surfaces presented distinct erosion，and the erosion became more significant with an increase of degradation time.The degradation products of PBS films were assayed as 1，4-butylene，1，4-succinate and butylene-succinate，but no other oligomers were found.

poly（butylenes succinate）；degradation；Acidovorax delafiedii

TQ323.4

：B

：1001-9278（2017）03-0094-06

10.19491/j.issn.1001-9278.2017.03.017

2016-09-18

國家自然科學(xué)基金項目（31570097）

*聯(lián)系人，wangzy125＠gmail.com