海洋氨肽酶菌株的篩選鑒定及其酶學(xué)特性研究

楊麗娜，遲乃玉，石群，王曉輝，張慶芳*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

海洋氨肽酶菌株的篩選鑒定及其酶學(xué)特性研究

楊麗娜1，2，遲乃玉1，2，石群1，2，王曉輝1，2，張慶芳1，2*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

從大連渤海海域海泥海水樣品中分離出一株高產(chǎn)海洋氨肽酶(aminopeptidase)菌株YZ1-2，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)(16S rDNA)鑒定，確定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。并對(duì)其產(chǎn)海洋氨肽酶進(jìn)行酶學(xué)特性研究，結(jié)果表明，最適作用溫度為30℃；最適作用pH值為8.5；Co2+、Zn2+等能較強(qiáng)地激活氨肽酶的活性，Ni2+、Ca2+等對(duì)酶的抑制性較強(qiáng)；乙二胺四乙酸(EDTA)可以有效地抑制氨肽酶活性。

海洋氨肽酶；篩選鑒定；蠟樣芽孢桿菌；酶學(xué)特性

氨肽酶（aminopeptidase）EC 3.4.11.11作為一種外肽酶，可將多肽鏈水解為小肽和游離的氨基酸[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)氨肽酶存在于多種生物中，如一些高等動(dòng)物的胰臟、腸液中，也廣泛分布于多種植物、微生物和原生動(dòng)物體內(nèi)[4]。蛋白質(zhì)水解生成的多肽、寡肽和少量氨基酸，其溶解性、營養(yǎng)特性及口感風(fēng)味較蛋白質(zhì)而言均可得到明顯改善[5]，是食品加工的主要原材料，因而蛋白質(zhì)的水解已成為現(xiàn)代食品加工中的重要課題[6]。但其水解液往往呈現(xiàn)苦味，這種苦味是由末端的疏水性氨基酸的多肽所導(dǎo)致的，從而限制了蛋白質(zhì)水解物的應(yīng)用[7]。因此，減少、阻止和去除蛋白質(zhì)水解物的苦味，就顯得尤為重要。目前，氨肽酶在食品工業(yè)上可以與蛋白酶協(xié)同作用，生產(chǎn)醬油等調(diào)味品、制備生物多肽以及對(duì)蛋白水解液進(jìn)行脫苦[8-9]。既增加了游離氨基酸的量，又可以提高營養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味。另外，氨肽酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還可用作分子工具測定蛋白序列[10]，以及在環(huán)境衛(wèi)生方面可以作為解毒劑或消毒劑等[11]。目前，國內(nèi)科研人員對(duì)氨肽酶的菌種來源大部分集中在陸地土壤、腐乳或購買于菌種保藏管理中心以及通過基因重組獲得等[12-13]，而來源于海洋菌株生產(chǎn)氨肽酶的研究尚鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用L-亮氨酸-4-硝基苯胺（L-leucine-4-nitroanilide，LNA）法，擬從渤海海域的海泥海水中分離得到一株產(chǎn)海洋亮氨酸氨肽酶的蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）。本研究初步探索了海洋氨肽酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及酶學(xué)特性，為后期海洋低溫氨肽酶的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

來源于中國遼寧大連渤海海域附近的海泥海水樣品（鹿島港，N：39°11′，S：121°35′；濱海路沿線，N：39°7′，S：121°41′；蕎麥山橋，N：39°13′，S：121°42′），現(xiàn)保存于實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中備用。

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YZ1-2：大連大學(xué)遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室分離、篩選及保藏。

1.1.2 試劑

L-亮氨酸-4-硝基苯胺（LNA）：大連凱美化工工程配套有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；核酸Marker：加拿大Fermentas MBI公司；引物（合成）、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（SK8255）：生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）的配制：121.1 g Tris，800 mL去離子水，加入約42 mL濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0。

26 mmol LNA乙醇溶液的配制：0.196 gL-亮氨酸-4-硝基苯胺，30 mL無水乙醇，混勻。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離篩選培養(yǎng)基：蔗糖30g/L，牛肉膏5g/L，LNA0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KH2PO41.0g/L，瓊脂粉20g/L，pH7.0。

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖6 g/L，K2HPO42 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl10g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉30 g/L，豆渣粉20 g/L，KH2PO40.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NaCl 1 g/L，CoCl20.1 g/L，pH 8.0。

以上培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；PH-3G pH計(jì)：陜西鼎盛儀器設(shè)備有限公司；UV-H232可見紫外分光光度計(jì)：菲迪康樂（廣州）科學(xué)儀器有限公司；2720 thermal cycler PCR擴(kuò)增儀：美國Applied Biosystems公司；DYY-5穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

菌株初篩：在以L-亮氨酸-4-硝基苯胺（LNA）為底物的分離培養(yǎng)基中挑選出帶有黃色水解圈的菌株，在氨肽酶作用下，可將無色的LNA分解生成黃色對(duì)硝基苯胺（p-nitroaniline，p-NA），根據(jù)生成的水解圈和菌落直徑比值的大小篩選出高活力的目的菌株[14]，轉(zhuǎn)接至固體斜面再次純化培養(yǎng)。

菌株復(fù)篩：以測定菌株氨肽酶酶活高低作為復(fù)篩依據(jù)，將初篩菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定酶活，逐步篩選出目的高產(chǎn)菌株。

1.3.2 氨肽酶活測定方法

將接種劃線培養(yǎng)的單菌落轉(zhuǎn)接于裝液量為100mL/250mL的一級(jí)種子培養(yǎng)基中，于26℃、200 r/min條件下培養(yǎng)10～12h，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次種子；以5%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

對(duì)發(fā)酵液離心，條件為4℃、8 000 r/min離心15 min，上清即為粗酶液。取0.4 mL粗酶液加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液6 mL，30℃水浴預(yù)熱5 min，加26 mmol/L LNA乙醇溶液0.4 mL，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，立即放冰浴中終止反應(yīng)，將在沸水浴中滅活粗酶液作為對(duì)照，其余條件同上，5 min后于波長405 nm處比色。根據(jù)下列公式計(jì)算酶活[15]。

式中：ΔOD405nm為反應(yīng)液測定前后吸光度變化值；6.8為反應(yīng)體系總體積，mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；10為反應(yīng)時(shí)間，min；0.4為樣品體積，mL。

氨肽酶酶活定義：在30℃、pH 8.0條件下，每分鐘水解生成1 μg對(duì)硝基苯胺（p-NA）所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）[16]。

1.3.3 菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)學(xué)鑒定

24 h后，觀察斜面培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征；挑取菌齡為24 h的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察結(jié)果。

（2）菌株生理生化特征鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]與《微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[18]，對(duì)該菌株進(jìn)行淀粉水解、油脂水解、明膠液化、石蕊牛乳試驗(yàn)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)、甲基紅（methyl red，MR）試驗(yàn)、伏-普（voges-prokauer，V-P）試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)。

（3）菌株分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255（上海生工）提取菌株基因組DNA。以篩選得到的菌株YZ1-2 DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和瓊脂糖凝膠電泳。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌種16S rDNA進(jìn)行序列比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），確定菌株同源性，并利用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

（1）氨肽酶最適作用溫度

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同溫度條件下（10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，并繪制溫度-相對(duì)酶活折線圖。

（2）氨肽酶的熱穩(wěn)定性

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同溫度條件下（30℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃）保溫10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，并繪制時(shí)間-相對(duì)酶活折線圖。

（3）氨肽酶最適作用pH

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0）的Tris-HCl緩沖液中，測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，并繪制pH值-相對(duì)酶活折線圖。

（4）氨肽酶的pH穩(wěn)定性

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，將酶液分別置于不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、10.5、11.0）的Tris-HCl緩沖液中保溫60 min，測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，并繪制pH值-相對(duì)酶活折線圖。

（5）金屬離子對(duì)氨肽酶活的影響

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，向酶液分別加入含有不同金屬離子（Co2+、Ca2+、K+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+）的鹽溶液，使反應(yīng)體系中金屬離子終濃度分別為1 mmol/L和10mmol/L，以不添加金屬離子的樣品為對(duì)照，測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，考察金屬離子對(duì)氨肽酶活的影響。

（6）抑制劑對(duì)氨肽酶活的影響

根據(jù)氨肽酶酶活測定方法，向酶液分別加入抑制劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），使得各反應(yīng)體系的終濃度為1 mmol/L，以不添加抑制劑的樣品為對(duì)照，測定其酶活，相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比，考察抑制劑對(duì)氨肽酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

對(duì)大連周邊海泥海水樣品中分離的菌株進(jìn)行初篩，得到9株具有黃色水解圈的菌株，并通過復(fù)篩，得到一株性能穩(wěn)定、活力較高的海洋氨肽酶菌株，現(xiàn)將其命名為YZ1-2。利用種子培養(yǎng)基甘油保藏于-20℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌株YZ1-2形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 菌株YZ1-2菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.1 Colonial morphology and microscopic morphology of strain YZ1-2

由圖1可知，菌株YZ1-2菌落較大，近似圓形，邊緣不整齊，呈毛玻璃狀，灰白色，不透明，用接種環(huán)易于挑取，中心有光澤，呈蠟燭樣顏色；革蘭氏染色結(jié)果陽性，呈桿狀，兩端生有芽孢。

2.3 生理生化鑒定

表1 菌株YZ1-2的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YZ1-2

由表1可知，菌株YZ1-2生理生化鑒定陽性反應(yīng)結(jié)果：淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)、伏-普（VP）試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)；陰性反應(yīng)結(jié)果：油脂水解試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、尿素水解試驗(yàn)。

2.4 分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)海洋氨肽酶高產(chǎn)菌株YZ1-2進(jìn)行序列鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為1 496 bp。

圖2 菌株YZ1-2 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification products electrophoregram of 16S rDNA of strain YZ1-2

將菌株YZ1-2的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知菌種的16SrDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，以MEGA5.05軟件構(gòu)建菌株YZ1-2系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，菌株YZ1-2與蠟樣芽孢桿菌同源性最高為100%，因此可以鑒定菌株YZ1-2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3 菌株YZ1-2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain YZ1-2 based on 16S rDNA sequence

2.5 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 酶最適作用溫度

由圖4可知，該海洋氨肽酶最適作用溫度為30℃，作用溫度＞45℃以后，氨肽酶活迅速下降，在20～45℃的溫度條件下，相對(duì)酶活能保持在80%以上，在10℃仍保有60%以上的相對(duì)酶活力，在65℃和70℃條件下，相對(duì)酶活不足20%，說明該酶在低溫條件下，活力較高，這符合低溫酶的特性，同時(shí)也是低溫酶的應(yīng)用優(yōu)勢[19]。

圖4 氨肽酶最適作用溫度Fig.4 The optimal temperature of the aminopeptidase

2.5.2 酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，該海洋氨肽酶熱穩(wěn)定性比較弱，隨著溫度的不斷升高，其相對(duì)酶活呈下降趨勢。經(jīng)45℃條件下處理30min后，相對(duì)酶活就已經(jīng)低于60%，且在50℃、60℃、70℃條件下分別處理10 min，相對(duì)酶活迅速下降，酶活經(jīng)60℃、70℃處理40 min，相對(duì)酶活均低于10%。分析其原因可能是低溫酶類具有較高的柔韌性，與底物結(jié)合可以消耗較低的能量，進(jìn)而使得酶的熱穩(wěn)定性降低[20-21]。

圖5 氨肽酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermostibility of the aminopeptidase

2.5.3 酶最適作用pH及穩(wěn)定性

由圖6可知，該氨肽酶的最適作用pH值為8.5，當(dāng)pH值≤7.0或pH值≥10.5時(shí)，其相對(duì)酶活均不足60%；由該氨肽酶的pH穩(wěn)定性折線可知，在pH值為5.0～8.5時(shí)，酶的穩(wěn)定性隨著pH的增加而升高；pH值為5.0時(shí)，相對(duì)酶活＜20%；pH值為7.0時(shí)，相對(duì)酶活＜60%；pH值為8.5時(shí)，相對(duì)酶活最高；且當(dāng)pH值為8.0～10.0時(shí)，該氨肽酶均有80%以上的酶活。但隨著pH越來越大，氨肽酶穩(wěn)定性也逐漸喪失。由此可以得出：在偏酸中性或過堿性環(huán)境下，均不利于氨肽酶發(fā)揮活性，而在弱堿性環(huán)境下，氨肽酶發(fā)揮活性較好，穩(wěn)定性最高，說明該氨肽酶有一定的耐弱堿性。

圖6 氨肽酶最適pH及其穩(wěn)定性Fig.6 The optimal pH and stability of the aminopeptidase

2.5.4 金屬離子對(duì)氨肽酶的影響

由表2可知，不同種類的金屬離子對(duì)該海洋氨肽酶的作用不同，同種金屬離子在不同終濃度條件下的酶活規(guī)律表現(xiàn)也不盡相同。其中，Co2+、Zn2+、Mg2+能較強(qiáng)的激活氨肽酶的活性；Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+對(duì)酶的抑制性較強(qiáng)，K+、Mn2+對(duì)酶的作用不明顯，且Mn2+對(duì)酶有較弱的激活作用。由此可以推測出該酶的活性中心構(gòu)象的維持可能與金屬離子有關(guān)[22]。

表2 金屬離子對(duì)氨肽酶活性的影響Table 2 Effects of metal ions on aminopeptidase activity

2.5.5 抑制劑對(duì)氨肽酶活的影響

表3 常見抑制劑對(duì)氨肽酶活的影響Table 3 Effects of common inhibitors on aminopeptidase activity

由表3可知，金屬螯合劑EDTA、蛋白質(zhì)變性劑SDS與還原劑DTT均可以有效的抑制氨肽酶活性，其中EDTA可強(qiáng)烈的抑制氨肽酶活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從渤海海域的海泥海水樣品中，初篩得到9株產(chǎn)海洋氨肽酶菌株，以發(fā)酵產(chǎn)酶能力作為復(fù)篩的依據(jù)，逐步篩選出一株高產(chǎn)菌株YZ1-2，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定以及分子生物學(xué)（16S rDNA）鑒定，鑒定菌株YZ1-2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。對(duì)其所產(chǎn)的海洋氨肽酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，最適作用溫度為30℃，酶的熱穩(wěn)定性較差，屬于低溫酶類；酶的最適作用pH值為8.5，且該酶的pH穩(wěn)定性大約在8.0～10.0，有一定的耐堿性；Co2+、Zn2+、Mg2+能較強(qiáng)的激活氨肽酶的活性，Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+對(duì)酶的抑制性較強(qiáng)，K+、Mn2+對(duì)酶的作用不明顯，且Mn2+對(duì)酶有較弱的激活作用；金屬螯合劑EDTA、蛋白質(zhì)變性劑SDS與還原劑DTT均可以有效的抑制氨肽酶活性，其中，EDTA的抑制作用最為明顯。

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Isolation and identification of a aminopeptidase-producing strain from marine and its enzymatic properties

YANG Lina1,2,CHI Naiyu1,2,SHI Qun1,2,WANG Xiaohui1,2,ZHANG Qingfang1,2*
(1.College of Life Science and Technology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center,Dalian 116622,China)

Ahigh marine aminopeptidase-producingstrain YZ1-2 wasisolated from sea water sample from the Dalian Bohai Sea area,and was identified asBacillus cereusby morphology,physiological and biochemical experiments,molecular biology(16S rDNA)identification.The enzymatic properties of aminopeptidase produced by strain YZ1-2 were researched.The results showed that the optimum temperature of enzymes was 30℃;the optimum pH was 8.5;the aminopeptidase activity could be strongly activated by Co2+,Zn2+,etc,and inhibited by Ni2+and Ca2+,etc.EDTA could effective inhibition on aminopeptidase activity.

marine aminopeptidase;isolation and identification;Bacillus cereus;enzymatic properties

Q93

0254-5071（2017）03-0066-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.014

2016-12-15

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”（2007AA021306）

楊麗娜（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿╅_發(fā)與利用。

*通訊作者：張慶芳（1965-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿╅_發(fā)與利用。