莪術(shù)油中吉馬酮在小鼠組織內(nèi)的分布研究

張輝靠，王冬東，孫程，呂曉敏，胡榮（揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001）

莪術(shù)油中吉馬酮在小鼠組織內(nèi)的分布研究

張輝靠＊，王冬東，孫程，呂曉敏，胡榮#（揚州大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225001）

目的：研究莪術(shù)油中吉馬酮在小鼠各組織中的分布特征，為莪術(shù)油的進一步應用提供參考。方法：取30只KM小鼠ig莪術(shù)油0.5 mL，分別于給藥1、2、4、8、12 h后隨機取6只，采用高效液相色譜法測定其心、肝、脾、肺、腎組織中吉馬酮含量；取15只KM小鼠，給藥法及取樣方法同上，每個時間點取3只，采用熒光法觀察上述組織切片中吉馬酮的熒光強度；兩個實驗均取相同數(shù)量小鼠作為對照。結(jié)果：1～4 h各組織吉馬酮濃度隨時間的延長而逐漸增加，4 h時達到峰值，且肝、脾濃度明顯高于心、肺，吉馬酮在各組織內(nèi)的濃度依次為肝＞脾＞腎＞心＞肺；各組織熒光強度觀察結(jié)果與上述結(jié)果一致。結(jié)論：兩種方法考察吉馬酮在小鼠組織中的分布特征一致，證明吉馬酮在肝、脾、腎中分布較多，在心、肺分布較少。

莪術(shù)油；組織分布；吉馬酮；高效液相色譜法；熒光觀察

莪術(shù)油為莪術(shù)經(jīng)水蒸氣蒸餾所得揮發(fā)油[1]，其中吉馬酮（牻牛兒酮）、β-欖香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等為其有效成分[2-3]，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多重藥理作用[4]。以莪術(shù)油中莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮為指標成分進行血漿濃度及藥動學研究常用方法包括毛細管氣相色譜法（CGC）[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7]等，尚缺乏對莪術(shù)油或其主要成分在組織分布的研究。吉馬酮是2015年版《中國藥典》（一部）中莪術(shù)油及莪術(shù)藥材項下的主要質(zhì)量控制指標成分，且在莪術(shù)油中含量較高，利于體內(nèi)試驗生物樣品的檢測，故本研究選擇莪術(shù)油中吉馬酮作為考察組織分布的含量測量指標。吉馬酮屬于倍半萜類化合物[8]，有較大的共軛體系，前期預實驗證實其具有熒光的特性，利用這一特性，在熒光顯微鏡下觀察各組織冰凍切片熒光[9]變化情況，可作為考察莪術(shù)油中吉馬酮在體內(nèi)的分布特征研究依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀，包括Waters 2998 PDA檢測器、Empower工作站（美國Waters公司）；970CRT熒光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；TDL-5離心機（昆山飛鴿離心機有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

莪術(shù)藥材（購自安徽省亳州市眾和中藥材銷售有限責任公司，經(jīng)揚州大學醫(yī)學院藥用植物與生藥教研室劉量博士鑒定，HPLC顯示含吉馬酮13.38%）；吉馬酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111665-201204，純度：100%）；美國櫻花O.C.T冷凍切片包埋劑（美國Sakura公司，批號：4583，規(guī)格：118 mL/支）；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

KM小鼠54只，♀♂各半，體質(zhì)量（25±2）g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供[許可證號：SYXK（蘇）2012-0029]。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水24 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)油樣品溶液的制備

取莪術(shù)藥材適量，按2015年版《中國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法甲法[10]提取，凍除水分，稱取5.00 g，置于50 mL量瓶中，定量加入聚山梨酯80，振搖混勻，加蒸餾水20 mL，超聲（功率：100 W）15 min，蒸餾水稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.10 g/mL的莪術(shù)油樣品溶液。

2.2 吉馬酮對照品溶液的制備

精密稱取吉馬酮對照品2 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解定容，制得0.20 mg/mL的吉馬酮對照品溶液，再用乙腈稀釋制成0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL的吉馬酮系列標準溶液。

2.3 樣品、空白組織勻漿液的采集與預處理

取30只KM小鼠ig“2.1”項下莪術(shù)油樣品溶液0.5 mL，分別于給藥1、2、4、8、12 h后隨機取6只，頸椎脫臼處死。摘取心、肝、脾、肺、腎，用濾紙吸除表面血液與水分后稱取質(zhì)量，分別加4倍量生理鹽水勻漿（g/mL），離心（離心半徑為10 cm，3 000 r/min，下同）15 min；吸取上清液300 μL，置于1.5 mL離心管中，加入乙腈0.6 mL，渦旋混合5 min后離心15 min；吸取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，即得樣品組織勻漿液。另取6只KM小鼠作為空白對照，于給藥前頸椎脫臼處死，同上法制得空白組織勻漿液。

2.4 吉馬酮的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，55%～65%A；15～30 min，65%～80%A）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL。

2.4.2 專屬性考察 取空白組織勻漿液、空白組織勻漿液+對照品溶液、樣品組織勻漿液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，吉馬酮的保留時間為23.6 min，在各組織內(nèi)分離度較好，組織液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測定。色譜圖見圖1（僅列出腎組織色譜圖，其余圖略）。

2.4.3 線性關(guān)系、定量下限和檢出限考察 精密吸取300 μL小鼠空白心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液，各7份，分別加入“2.2”項下吉馬酮系列標準溶液20 μL，渦旋混合，制成質(zhì)量濃度分別為0.033、0.067、0.133、0.333、0.667、1.000、1.333μg/mL的生物質(zhì)控樣品（即相當于在各組織中的濃度為0.133、0.267、0.533、1.333、2.667、4.000、5.333μg/g），按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。以各組織中吉馬酮濃度（x，μg/g）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。各組織中吉馬酮的線性方程、定量下限（信噪比為10）、檢出限（信噪比為3）見表1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 各組織中吉馬酮的線性方程、定量下限和檢出限結(jié)果（n＝7，μg/g）Tab 1 Regression equation，lower limit of quantitation and detection of germacrone in each tissue of mice（n＝7，μg/g）

2.4.4 精密度試驗 精密吸取空白心、肝、脾、肺、腎組織勻漿液適量，分別加入吉馬酮標準溶液適量，渦旋混合，制備成0.267、1.333、5.333μg/g的生物質(zhì)控樣品。按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，考察日內(nèi)精密度和連續(xù)6 d的日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)RSD均小于5%（n＝6）、日間RSD均小于11%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.4.4”項下生物質(zhì)控樣品適量，分別測定室溫放置12 h、4℃保存4周、－20℃反復凍融3次的穩(wěn)定性，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，3項穩(wěn)定性試驗的RSD均小于10%（n＝6），表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.6 準確度試驗 以方法回收率考察本方法的準確度。精密吸取“2.4.4”項下生物質(zhì)控樣品溶液適量，共6份，按“2.4”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，各生物質(zhì)控樣品的方法回收率均在93%～102%之間（RSD＜15%，n＝6），表明本方法的準確度良好。

2.5 吉馬酮在小鼠各組織分布考察

按“2.3”項下方法收集和處理組織勻漿，按“2.4”項下色譜條件進樣測定，測定各組織各時間點吉馬酮的含量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，1～4 h各組織中吉馬酮濃度隨時間的延長而增加；在給藥后4 h，各組織中吉馬酮的濃度達到峰值，且肝、脾中濃度明顯高于心、肺；4～12 h組織濃度呈現(xiàn)下降趨勢。吉馬酮在各組織內(nèi)的濃度大小依次為：肝＞脾＞腎＞心＞肺，第12 h心和肺內(nèi)已不能檢測出。

圖2 小鼠各組織中吉馬酮的濃度（n＝6，μg/g）Fig 2 The concentration of germacrone in each tissue of mice（n＝6，μg/g）

2.6 小鼠各組織切片熒光觀察

取15只KM小鼠ig吉馬酮對照品溶液0.5 mL（0.5 mg/mL，溶劑為10%乙醇），分別于給藥1、2、4、8、12 h后隨機取3只，頸椎脫臼處死后，取出心、肝、脾、肺、腎，用濾紙吸除表面血液與水分后稱取質(zhì)量，冰凍切10 μm片；另取3只作為空白對照，于給藥前處死，其余方法同上。各組織用黏附性載玻片黏附并標記，依次置于熒光顯微鏡下觀察。小鼠各組織中吉馬酮的熒光強度觀察結(jié)果見表2。

表2 小鼠各組織中吉馬酮的熒光強度觀察結(jié)果（n＝3）Tab 2 Fluorescence intensity of germacrone in each tissue of mice（n＝3）

由表2可知，吉馬酮ig后，小鼠各組織中呈現(xiàn)了明顯的熒光分布規(guī)律。1～4 h，各組織中的熒光強度隨著時間的變化而逐漸增強；在4 h時，各組織熒光強度達到最強值，各組織中的熒光強度排序為：肝＞脾＞腎＞心＞肺；4～12 h，各組織中熒光強度逐漸減弱；在12 h時，心、肺組織中已很難觀察到熒光。

3 討論

藥物被機體吸收后，由循環(huán)系統(tǒng)運送到各個組織器官。藥物的組織分布受多種因素的影響，如藥物的理化性質(zhì)、與組織的親和力等。了解藥物的組織分布特點，有助于更好地發(fā)揮藥物療效。本研究采用ig給藥方式，通過兩種方法考察了莪術(shù)油中吉馬酮在小鼠體內(nèi)的組織分布情況，結(jié)果可靠、直觀。前期預試驗中，研究組對組織切片的方法進行考察發(fā)現(xiàn)，冰凍切片法[11]較石蠟切片快捷、簡便，較好地保留了新鮮組織中原型藥物。因此采用此法對吉馬酮ig給藥后的新鮮組織樣品進行切片，再在熒光顯微鏡下觀察其熒光強弱。

小鼠單次ig莪術(shù)油或吉馬酮對照品后，通過吉馬酮含量測定及熒光觀察，可以得出吉馬酮在小鼠各組織中的分布隨著時間的變化而變化。4 h時，吉馬酮組織濃度達到最高，在組織中的總體分布趨勢為：肝＞脾＞腎＞心＞肺，說明吉馬酮與肝、脾親和力較高，與莪術(shù)油歸肝、脾經(jīng)的中醫(yī)藥理論相符。莪術(shù)油在臨床上主要用于抗病毒、抗炎，這可能與其主要成分吉馬酮作用于脾臟組織、提高了機體自身的免疫力有關(guān)。

綜上所述，莪術(shù)油中吉馬酮在小鼠肝、脾、腎組織中分布較多，在心、肺分布較少，為莪術(shù)油口服制劑研發(fā)及含吉馬酮相關(guān)制劑的組織分布研究提供了參考，同時也為莪術(shù)油的歸經(jīng)理論提供了一定的現(xiàn)代科學依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：412-413.

[2] He H，Ma S，Tian S，et al.HPLC determination of six components in zedoary turmeric oil and its related injections[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2010，35（5）：593-597.

[3] Chen M，Wang S，Tan M，et al.Applications of nanoparticles in herbal medicine：zedoary turmeric oil and its active compound β-elemene[J].Am J Chin Med，2011，39（6）：1093-1102.

[4] 展曉日，曾昭武，孟凡莉，等.莪術(shù)油藥學研究進展[J].杭州師范大學學報（自然科學版），2011，10（5）：454-458.

[5] 孫艷濤，張振秋，李想，等.CGC法同時測定兩種莪術(shù)油在大鼠血漿中莪術(shù)醇和莪術(shù)二酮的含量[J].中成藥，2010，32（6）：991-995.

[6] Peng Y，Zhang M，Li W，et al.A validated LC-MS/MS assay for the quantitative determination of curdione in rabbit plasma and its application to a pharmacokinetic study after administration of zedoary turmeric oil and bioavailability of the oil[J].Biomed Chromatogr，2014，28（10）：1360-1365.

[7] 季德，毛春芹，李金慈，等.莪術(shù)揮發(fā)油中莪術(shù)二酮、吉馬酮在大鼠體內(nèi)的藥動學研究[J].中成藥，2013，35（12）：2622-2626.

[8] 崔友，孫秀燕，張慧.薄層色譜法鑒定莪術(shù)油中倍半萜類成分的研究[J].中草藥，2010，41（7）：1119-1121.

[9] 蔣瑩.熒光法在生物樣品理化檢測標準中的應用進展[J].中國醫(yī)藥指南，2016，14（4）：45-46.

[10] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：203-204.

[11] Taylor SR，Jorgensen JB.Use of fluorescent angiography to assess donor site perfusion prior to free tissue transfer [J].Laryngoscope，2015，125（6）：192-197.

（編輯：劉明偉）

Study on the Distribution of Germacrone from Zedoary Turmeric Oil in Tissues of Mice

ZHANG Huikao，WANG Dongdong，SUN Cheng，LYU Xiaomin，HU Rong（Medical College of Yangzhou University，Jiangsu Yangzhou 225001，China）

OBJECTIVE：To study the distribution characteristics of germacrone from zedoary turmeric oil（ZTO）in each tissue of mice，and to provide reference for further application of zedoary turmeric oil.METHODS：30 KM mice were given zedoary turmeric oil 0.5 mL；6 mice were randomly selected 1，2，4，8，12 h after medication，respectively.The contents of germacrone in heart，liver，spleen，lung and kidney tissues were determined by HPLC.15 KM mice were selected，medication and sampling method were same as above；3 mice were collected at each time point respectively.The fluorescence intensity of germacrone in above sections were observed by fluorescence.The same number of mice were selected as control in 2 trials.RESULTS：The concentration of germacrone in each tissue 1-4 h increased gradually as time and reached the peak value at 4 h.The contents of germacrone in liver and spleen were significantly higher than in heart and lung.The concentrations of germacrone in each tissue were ranked as liver＞spleen＞kidney＞heart＞lung.The results of fluorescence intensity observation was same as above results.CONCLUSIONS：Results of 2 methods show same distribution characteristics of germacrone in mice tissues，and indicate that germacrone is distributed more in liver，spleen and kidney tissues and less in heart and lung.

Zedoary turmeric oil；Tissue distribution；Germacrone；HPLC；Fluorescence observation

R285.5；R969.1

A

1001-0408（2017）04-0512-03

2016-06-21

2016-10-18）

＊碩士研究生。研究方向：中藥制劑。E-mail：yxzhk1314@163. com

#通信作者：教授，碩士。研究方向：藥物制劑。電話：0514-87978840。E-mail：398563432@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.22