何首烏乙酸乙酯提取物對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的抗衰老作用研究Δ

唐進(jìn)法，張帆，李宇輝，吳宿慧，李寒冰，李偉霞，李學(xué)林#（.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000；.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450000）

何首烏乙酸乙酯提取物對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的抗衰老作用研究Δ

唐進(jìn)法1＊，張帆2，李宇輝2，吳宿慧2，李寒冰2，李偉霞1，李學(xué)林1#（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450000）

目的：研究何首烏乙酸乙酯提取物（EPM）對(duì)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)（簡(jiǎn)稱(chēng)“線(xiàn)蟲(chóng)”）壽命的影響，考察EPM抗衰老作用。方法：設(shè)立EPM低、中、高濃度組（25、37.5、50 mg/L，以生藥計(jì)）和空白組（0 mg/L），考察EPM對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響；設(shè)立EPM組（37.5 mg/L）和空白組（0 mg/L），分別進(jìn)行線(xiàn)蟲(chóng)的生殖實(shí)驗(yàn)、急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)和急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，考察EPM對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力以及壓力應(yīng)激的影響。結(jié)果：在壽命實(shí)驗(yàn)中，EPM低、中、高濃度組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命較空白組均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05或P＜0.01），以中濃度EPM作用最為明顯；增殖實(shí)驗(yàn)中，EPM組線(xiàn)蟲(chóng)在第2、3天中的子代數(shù)量較空白組顯著增加（P＜0.05）；在急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)和急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，EPM組線(xiàn)蟲(chóng)的平均生存時(shí)間較空白組明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)論：37.5 mg/L的EPM能延緩線(xiàn)蟲(chóng)衰老且不損害其生殖能力。

何首烏；乙酸乙酯提取物；抗衰老；秀麗線(xiàn)蟲(chóng)；壽命；氧化應(yīng)激；熱應(yīng)激

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorumThunb.）的干燥塊根，味苦、甘、澀，性微溫，炮制后具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)等作用。《本草綱目》載：“何首烏……久用長(zhǎng)筋骨、益精髓、延年不老……”[1]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，制首烏主要含有二苯乙烯苷類(lèi)、磷脂等成分，具有抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的抗衰老中藥[2-3]。目前，何首烏抗衰老的作用及其機(jī)制研究多以小鼠、果蠅、鶴鶉等[4-5]作為動(dòng)物模型，但因培養(yǎng)條件高、壽命周期長(zhǎng)、研究成本高、近親繁殖等因素限制了對(duì)其更深入的研究。

有研究表明，daf-2突變體的壽命是正常壽命的2倍，這標(biāo)志著秀麗線(xiàn)蟲(chóng)正式進(jìn)入衰老研究領(lǐng)域[6]。因其具有易飼養(yǎng)、自我繁殖力強(qiáng)、與人類(lèi)的同源性基因數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，使其逐漸成為國(guó)際上公認(rèn)的研究抗衰老的模式生物，有望替代小鼠等動(dòng)物模型成為中藥抗衰老研究的首選模型[7-10]。本研究以野生秀麗線(xiàn)蟲(chóng)（株系N2）的存活時(shí)間、生殖能力和急性熱、氧化應(yīng)激能力等作為指標(biāo)，研究何首烏乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extract fromP.multiflora，EPM）的抗衰老作用，為進(jìn)一步研究其抗衰老機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SMZ-140臺(tái)式顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

1.2 藥材與試劑

何首烏采自廣州石鼓鎮(zhèn)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為正品；氯仿、乙酸乙酯和二甲基亞砜等試劑均為分析純。

1.3 菌株與線(xiàn)蟲(chóng)

大腸埃希菌（OP50）和野生秀麗線(xiàn)蟲(chóng)（N2）均由北京生命科學(xué)院董夢(mèng)秋實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 藥材的處理

2.1.1 藥材的炮制 取適量何首烏，用80%黑豆汁拌勻悶潤(rùn)約8 h，高壓清蒸6 h，然后將樣品置于采光好的地方，放置1天1夜使其干透，此為一蒸一曬。反復(fù)9次蒸、曬即得[11]。

2.1.2 藥液的制備 取283 g上述何首烏炮制品，加10倍量水提取，將水提液濃縮至168 mL后，取84 mL濃縮液，依次用等體積氯仿萃取5次，收集萃取液。取上層萃取液，用等體積乙酸乙酯萃取9次，收集萃取液并置于水浴鍋中揮干溶劑，即得EPM。取適量EPM，由二甲基亞砜（濃度＜1%）助溶于超純水中，制備成質(zhì)量濃度分別為25、37.5、50 mg/L的EPM藥液。

2.2 線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)

將線(xiàn)蟲(chóng)接種于涂布有大腸埃希菌的NGM（Nematode growth media）培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況并定期更換培養(yǎng)基[12]。挑選表面光滑、無(wú)氣泡、無(wú)劃痕的培養(yǎng)基進(jìn)行接種。

2.3 線(xiàn)蟲(chóng)的壽命實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置EPM低、中、高濃度組（25、37.5、50 mg/L，以生藥計(jì)）和空白組（0 mg/L）。參考文獻(xiàn)[13]中方法，每個(gè)組分別挑取2～3條生殖期線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵1 h后均放入20℃生化培養(yǎng)箱中；待發(fā)育至第四階段幼蟲(chóng)期（即L4期）后，轉(zhuǎn)入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)皿中。每組線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量均為20條，此時(shí)記為壽命實(shí)驗(yàn)第0天。每天觀(guān)察并記錄線(xiàn)蟲(chóng)生存、死亡及剔除的數(shù)量（在壽命實(shí)驗(yàn)期間，發(fā)現(xiàn)線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)外界刺激沒(méi)有應(yīng)答時(shí)視為死亡；剔除逃離培養(yǎng)基表面而干死、蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲(chóng)或者鉆進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)部的線(xiàn)蟲(chóng)[14]）。

2.4 線(xiàn)蟲(chóng)的生殖實(shí)驗(yàn)

每組分別挑選10條L4期線(xiàn)蟲(chóng)（同壽命實(shí)驗(yàn)），單獨(dú)每條轉(zhuǎn)至標(biāo)記的空白組（0 mg/L）和EPM組（37.5 mg/L）中，此時(shí)記為生殖實(shí)驗(yàn)第1天。以后每24 h移至相應(yīng)的培養(yǎng)基中直至線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力喪失。將線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移前的培養(yǎng)基置于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計(jì)算子代數(shù)量（即產(chǎn)卵數(shù)量）[15]。

2.5 線(xiàn)蟲(chóng)的急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

[16]中方法，將線(xiàn)蟲(chóng)分別置于空白組（0 mg/L）和EPM組（37.5 mg/L）的培養(yǎng)基中產(chǎn)卵0.5 h；將受精卵在20℃條件下孵育58 h后，在35℃條件下進(jìn)行熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。每隔1 h記錄1次每組線(xiàn)蟲(chóng)死亡以及存活的數(shù)量（線(xiàn)蟲(chóng)死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)同壽命實(shí)驗(yàn)）。

2.6 線(xiàn)蟲(chóng)的急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[17]方法，將線(xiàn)蟲(chóng)置于空白組（0 mg/L）或EPM組（37.5 mg/L）的培養(yǎng)基中產(chǎn)卵0.5 h；將受精卵在20℃下孵育58 h后，將線(xiàn)蟲(chóng)分別置于標(biāo)記好的含有0.4 mmol/L雙氧水（H2O2）的96孔板中，每個(gè)孔內(nèi)放置5條線(xiàn)蟲(chóng)，每0.5 h記錄1次線(xiàn)蟲(chóng)死亡以及存活的數(shù)量（線(xiàn)蟲(chóng)死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)同壽命實(shí)驗(yàn)）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的EPM均能使線(xiàn)蟲(chóng)的生命曲線(xiàn)右移（詳見(jiàn)圖1），均能延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)的壽命?？瞻捉M和EPM低、中、高濃度組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命分別為（17.50±6.88）、（22.40±8.16）、（23.50±7.42）、（22.97±7.86）d。這提示EPM低、中、高濃度組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且以EPM質(zhì)量濃度為37.5 mg/L時(shí)延長(zhǎng)壽命效果最好。因此用該質(zhì)量濃度作為其他生理指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 不同質(zhì)量濃度EPM作用后秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的生命曲線(xiàn)Fig 1 Life curves of caenorhabditis elegans after different concentrations of EPM

3.2 生殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EPM組和空白組線(xiàn)蟲(chóng)均為培養(yǎng)第2天的子代數(shù)量最多，之后呈下降趨勢(shì)。其中培養(yǎng)第2、3天后EPM組的子代數(shù)量均顯著多于空白組（P＜0.05）；在總子代數(shù)量上，EPM組多于空白組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果詳見(jiàn)表1。

3.3 急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EPM能顯著增強(qiáng)線(xiàn)蟲(chóng)的耐熱能力，延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)在35℃條件下的平均存活時(shí)間。與空白組線(xiàn)蟲(chóng)的平均存活時(shí)間[（16.23±1.65）d]比較，EPM組線(xiàn)蟲(chóng)的平均存活時(shí)間（[17.83±1.45）d]顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。

3.4 急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EPM能顯著提高線(xiàn)蟲(chóng)的抗氧化能力，延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)在0.4 mmol/L H2O2中的平均存活時(shí)間。與空白組線(xiàn)蟲(chóng)的平均存活時(shí)間[（5.810±1.800）d]比較，EPM組線(xiàn)蟲(chóng)的平均存活時(shí)間[（7.287±2.030）d]顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。

表1 各組線(xiàn)蟲(chóng)子代數(shù)量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

表1 各組線(xiàn)蟲(chóng)子代數(shù)量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank group，＊P＜0.05

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4 討論

線(xiàn)蟲(chóng)同期化即將所需的線(xiàn)蟲(chóng)控制在同一發(fā)育期，這將有利于對(duì)其表征進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，故在測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)前需要對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行同期化處理。當(dāng)所需同期化線(xiàn)蟲(chóng)少時(shí)，可采用限時(shí)產(chǎn)卵法進(jìn)行處理[13]；反之，可采用高氯酸鈉漂白法[9]進(jìn)行處理。飲食限制即對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行熱量限制，是延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的一種方法。因此，在進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)前應(yīng)考慮EPM是否具有抑制大腸埃希菌的作用，設(shè)定藥液的質(zhì)量濃度應(yīng)低于藥物對(duì)大腸埃希菌最小抑制濃度（MIC）[18]。筆者在前期抑菌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EPM對(duì)大腸埃希菌的MIC為60 mg/L，且自該質(zhì)量濃度起對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)毒害作用，個(gè)別線(xiàn)蟲(chóng)的受精卵聚于陰戶(hù)，形成異形蟲(chóng)。因此，在本研究壽命實(shí)驗(yàn)中設(shè)置EPM質(zhì)量濃度分別為25、37.5、50 mg/L。

常見(jiàn)的線(xiàn)蟲(chóng)給藥方式有以下兩種：（1）在配制NGM培養(yǎng)基時(shí)添加所需質(zhì)量濃度的藥液，再經(jīng)過(guò)滅菌分裝即可[19]；（2）先配制好所需不同質(zhì)量濃度的藥液，然后將各質(zhì)量濃度藥液直接滴加至涂布有大腸埃希菌的NGM培養(yǎng)基中[14]。然而值得考慮的是，在第一種方法中藥物有效成分的含量以及藥效是否會(huì)受到滅菌操作的影響；第二種方法中線(xiàn)蟲(chóng)是否有可能進(jìn)食不含藥液的大腸埃希菌。綜合以上考慮，在本研究中筆者先將一定量大腸埃希菌和不同質(zhì)量濃度的藥液混合均勻后，再一起滴加至NGM培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)若干小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

部分科學(xué)家認(rèn)為長(zhǎng)壽和生殖力之間存在“利弊權(quán)衡”，即壽命延長(zhǎng)和生殖能力成反比。延長(zhǎng)壽命和生殖需要資源，而體內(nèi)的資源是有限的，延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命這部分資源應(yīng)該是來(lái)源于降低繁殖后代能力的資源[20]。但隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩者并不總是成反比，如蔡外嬌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮不僅能延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命，而且能提高其生殖能力；何首烏中所含的白藜蘆醇在延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的同時(shí)不影響其生殖能力[19]?？梢?jiàn)，本研究考察線(xiàn)蟲(chóng)的生殖指標(biāo)是有意義的。在抗衰老研究中，壓力應(yīng)激實(shí)驗(yàn)也是較為重要的[22]。研究顯示，壽命的延長(zhǎng)有可能是因?yàn)閼?yīng)激能力的提升，而且已知線(xiàn)蟲(chóng)的長(zhǎng)壽突變體在熱休克、氧化以及紫外輻射等壓力下，存活率均高于同等條件下的野生型線(xiàn)蟲(chóng)[6]。

本研究?jī)H采用野生型秀麗線(xiàn)蟲(chóng)N2進(jìn)行壽命、生殖等生理指標(biāo)的測(cè)定，下一步可再采用某些基因型的突變體進(jìn)一步驗(yàn)證所得結(jié)論。秀麗線(xiàn)蟲(chóng)自身對(duì)外界環(huán)境影響較為敏感，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)盡量排除干擾因素，增大樣本，減少誤差。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中添加的二甲基亞砜是非質(zhì)子極性溶劑，也是一種透皮吸收劑，可促進(jìn)藥物的滲透。關(guān)于壽命實(shí)驗(yàn)的分組，本研究只設(shè)置了空白組和EPM組，還可以考慮添加二甲基亞砜組。目前，線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)的給藥方式常用的有兩種，可設(shè)立這兩種不同加藥方式的分組，分別與空白組進(jìn)行比較，從而得出最佳的給藥方式。

本研究結(jié)果顯示，EPM組（37.5 mg/L）線(xiàn)蟲(chóng)在各項(xiàng)指標(biāo)上與空白組比較均有顯著差異，這證明了EPM能延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命、提升線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力、延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)在壓力應(yīng)激環(huán)境下的平均存活時(shí)間，具有延緩衰老的功效。本課題組后續(xù)將重點(diǎn)開(kāi)展EPM抗衰老的機(jī)制研究。

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Anti-aging Effect Study of Ethyl Acetate Extract from Folygonum multiflora on Caenorhabditis Elegans

TANG Jinfa1，ZHANG Fan2，LI Yuhui2，WU Suhui2，LI Hanbing2，LI Weixia1，LI Xuelin1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To study the lifespan effect of ethyl acetate extract fromPolygonum multiflora（EPM）on caenorhabditis elegans，and to investigate its anti-aging effect.METHODS：EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（25，37.5，50 mg/L，calculated by crude drug）and blank group（0 mg/L）were established to investigate the effects of EPM on the lifespan of caenorhabditis elegans.EPM group（37.5 mg/L）and blank group（0 mg/L）were established to perform reproductive test，acute heat stress test and acute oxidative stress test of caenorhabditis elegans.The effects of EPM on reproductive capacity and pressure stress of caenorhabditis elegans were investigated.RESULTS：The lifespan test，average lifespan of cae-norhabditis elegans in EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were prolonged significantly，compared to blank group（P＜0.05 or P＜0.01），especially in EPM medium-concentration group.In reproductive test，the number of offspring of caenorhabditis elegans in EPM group on the second and third day were increased significantly，compared to blank group（P＜0.05）.In acute heat stress test and acute oxidative stress test，average survival time of caenorhabditis elegans in EPM group was prolonged significantly（P＜0.05）.CONCLUSIONS：37.5 mg/L EPM can retard the aging process of caenorhabditis elegans and doesn't damage the reproductive capacity.

Polygonum multiflora；Ethyl acetate extract；Anti-aging；Caenorhabditis elegans；Lifespan；Oxidative stress；Heat stress

R285

A

1001-0408（2017）04-0493-04

2016-03-28

2016-06-20）

（編輯：林靜）

2015年度河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專(zhuān)項(xiàng)課題（No.2015ZY02101）

＊副主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥動(dòng)學(xué)。電話(huà)：0371-66233562。E-mail：a0519@163.com

#通信作者：主任藥師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥的合理應(yīng)用及中藥的應(yīng)用形式。電話(huà)：0371-66245342。E-mail：lixuelin450000@ 163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.17