川芎嗪聯(lián)合乙酰半胱氨酸對慢性應(yīng)激大鼠外周促炎細(xì)胞因子和腸道微生態(tài)的影響Δ

汪英（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腫瘤科，成都 610075）

川芎嗪聯(lián)合乙酰半胱氨酸對慢性應(yīng)激大鼠外周促炎細(xì)胞因子和腸道微生態(tài)的影響Δ

汪英＊（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)腫瘤科，成都 610075）

目的：考察川芎嗪聯(lián)合乙酰半胱氨酸（NAC）對慢性應(yīng)激大鼠外周促炎細(xì)胞因子和腸道微生態(tài)的影響。方法：將正常大鼠作為正常對照組，將慢性應(yīng)激大鼠分為模型組、NAC組（60 mg/kg）和川芎嗪+NAC組（15 mg/kg+60 mg/kg），每組20只，ig相應(yīng)藥物15 d。記錄各組大鼠一般檢查情況，檢測血清中白細(xì)胞介素6（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（INF-γ）水平，檢測腸道菌群。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組大鼠呈現(xiàn)慢性應(yīng)激癥狀，血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平均增強；腸道中的大腸埃希菌和腸球菌增加，乳桿菌和雙歧桿菌減少（P＜0.05）。與模型組比較，NAC組和川芎嗪+NAC組大鼠慢性應(yīng)激癥狀減輕，上述指標(biāo)均改善（P＜0.05），其中川芎嗪+NAC組效果優(yōu)于NAC組（P＜0.05）。結(jié)論：川芎嗪聯(lián)合NAC可通過降低促炎細(xì)胞因子水平和改善腸道微生態(tài)來改善大鼠慢性應(yīng)激狀態(tài)。

川芎嗪；乙酰半胱氨酸；慢性應(yīng)激；大鼠；促炎細(xì)胞因子；腸道微生態(tài)

隨著人們生活和工作壓力的增大，機體長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，嚴(yán)重影響人們的身心健康。慢性應(yīng)激的發(fā)病與生物、心理和社會等多因素有關(guān)，嚴(yán)重時可致人死亡[1]。探討慢性應(yīng)激對于體內(nèi)炎癥和腸道微生態(tài)的影響對于分析慢性應(yīng)激的發(fā)病、預(yù)防及治療具有重要意義。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC），簡稱乙酰半胱氨酸，早期用于黏液溶解，隨著人們的深入研究，NAC已作為臨床廣泛使用的抗氧化劑，具有明顯的抗氧化和抗炎效應(yīng)。川芎嗪（Ligustrazine）是傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong）的有效成分[2]，川芎嗪能直接清除具細(xì)胞毒性作用的自由基，具有一定的抗氧化和抗炎作用[3]。有研究顯示，川芎嗪與NAC聯(lián)用治療肺纖維化、肝硬化，均獲得良好療效[4]。本文通過考察川芎嗪與NAC聯(lián)用對慢性應(yīng)激大鼠的外周血促炎細(xì)胞因子和腸道微狀態(tài)的影響，為二者臨床聯(lián)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

M15全自動酶標(biāo)分析儀（上海纖檢儀器有限公司）；FA1104電子天平（上海天平儀器廠）；TGL-16G離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠，離心半徑：16 cm）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸川芎嗪片（麗珠集團利民制藥廠，批號：1508012，規(guī)格：每片50 mg）；NAC顆粒（海南贊邦制藥有限公司，批號：1580101，規(guī)格：每袋0.1 g）；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（INF-γ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：2014031A、201406E2、20150603、20150402）；大腸埃希菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基（上海哈永生物科技有限公司，批號：20140203T、2014201、20140206、2014308）。

1.3 動物

SPF級健康大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供，合格證號：SCXK（川）-2008-24。本實驗經(jīng)院內(nèi)倫理委員會同意。

2 方法

2.1 慢性應(yīng)激大鼠模型的建立

2.1.1 束縛應(yīng)激 采用自制的束縛筒。束縛筒分前后兩部分，前部是薄鐵皮卷成的圓錐形筒，長約5 cm，大口直徑6 cm，小口直徑2 cm，后部為圓錐形筒的大口處連接長30 cm的袖套，袖套口徑10 cm。將大鼠從袖套驅(qū)入，使頭部進入鐵皮錐筒，固定大鼠，使之無活動空間，并懸放在斜度為15°的斜坡上，持續(xù)6 h。

2.1.2 強迫游泳應(yīng)激 將大鼠置于深度為50 cm的水池中，水溫為（25±2）℃。將大鼠尾部系相當(dāng)于1/5體質(zhì)量的負(fù)荷，直至衰竭，即大鼠鼻子沒入水中8 s。

2.1.3 噪聲應(yīng)激 將大鼠放入噪聲參數(shù)1 500 Hz、92 dB的環(huán)境中1 h。

將所有大鼠貫序進行上述3種應(yīng)激刺激48 d建立慢性應(yīng)激模型，第1、6、9、10、13、18、20、24、27、30、33、36、39、42、45、48天進行束縛應(yīng)激，第2、5、8、12、15、17、21、23、25、29、31、35、38、41、43、47天進行強迫游泳應(yīng)激，第3、4、7、11、14、16、19、22、26、28、32、34、37、40、44、46天進行噪聲應(yīng)激。

2.2 分組與給藥

取正常大鼠作為正常對照組，將已建立慢性應(yīng)激模型的大鼠分為模型組、NAC組（60 mg/kg）和川芎嗪+ NAC組（15 mg/kg+60 mg/kg），每組20只。各給藥組大鼠連續(xù)ig相應(yīng)藥物15 d，正常對照組和模型組大鼠ig給予生理鹽水，ig體積為20 mL/kg。川芎嗪和NAC的給藥劑量均按人臨床常用劑量換算，給藥順序為先NAC，15 min后再給予川芎嗪。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 一般檢查 記錄實驗過程中各組大鼠飲食情況、精神狀態(tài)、自主活動、皮毛狀況等。

2.3.2 ELISA法檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平 給藥結(jié)束，所有大鼠禁食不禁水12 h，然后麻醉，斷尾取血，每只5 mL，抗凝，－70℃保存。嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作，采用酶標(biāo)分析儀檢測各組大鼠外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平。

2.3.3 平板培養(yǎng)法分析大鼠腸道菌群 給藥結(jié)束，所有大鼠禁食不禁水12 h，斷頸處死，開腹，游離盲腸，取內(nèi)容物1 g，置于帶玻璃珠的試管，加9 mL生理鹽水，渦旋混勻制成勻漿。用生理鹽水再稀釋10倍，分別取稀釋液50μL，均勻涂抹在大腸埃希菌、腸球菌、乳桿菌和雙歧桿菌4種選擇性培養(yǎng)基上，分別在37℃下培養(yǎng)24 h。計算單位質(zhì)量盲腸內(nèi)容物活菌集落數(shù)對數(shù)值（CFU/g）＝lg{[樣本質(zhì)量（g）+稀釋液體積（mL）]/樣本質(zhì)量×稀釋倍數(shù)×菌落數(shù)×100}。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。促炎細(xì)胞因子和腸道菌群等正態(tài)計量資料采用±s表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；大鼠例數(shù)和菌群數(shù)等計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義，檢驗水平α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況

正常對照組大鼠的飲食、精神與活動狀態(tài)良好。其余各組大鼠均呈現(xiàn)不同程度的食欲不振、精神萎靡、活動減少、毛發(fā)無光澤、對外界刺激反應(yīng)遲鈍和體質(zhì)量降低。其中模型組大鼠上述狀況最明顯，川芎嗪+NAC組大鼠狀態(tài)較好，NAC組大鼠狀態(tài)介于模型組和川芎嗪+ NAC組之間。

3.2 血清中促炎細(xì)胞因子表達

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平均升高（P＜0.05）。與模型組比較，NAC組和川芎嗪+NAC組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平均降低（P＜0.05）。與NAC組比較，川芎嗪+NAC組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平均降低（P＜0.05）。各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平的測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平的測定結(jié)果（±s，n＝20，ng/L）Tab 1 Level of IL-6，IL-1β，TNF-α and INF-γ in serum of rats in each group（±s，n＝20，ng/L）

表1 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ水平的測定結(jié)果（±s，n＝20，ng/L）Tab 1 Level of IL-6，IL-1β，TNF-α and INF-γ in serum of rats in each group（±s，n＝20，ng/L）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與NAC組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.NAC group，ΔP＜0.05

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3.3 對腸道菌群的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠盲腸中的大腸埃希菌和腸球菌增加（P＜0.05），乳桿菌和雙歧桿菌減少（P＜0.05）；NAC組大鼠盲腸中的雙歧桿菌減少（P＜0.05）。與模型組比較，NAC組和川芎嗪+NAC組大鼠盲腸中的大腸埃希菌和腸球菌減少（P＜0.05），乳桿菌和雙歧桿菌增加（P＜0.05）。與NAC組比較，川芎嗪+NAC組大鼠盲腸中的大腸埃希菌和腸球菌減少（P＜0.05），乳桿菌和雙歧桿菌增加（P＜0.05）。各組大鼠腸道菌群的測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群的測定結(jié)果（±s，n＝20，CFU/g）Tab 2 Determination results of intestinal microflora in rats of each group（±s，n＝20，CFU/g）

表2 各組大鼠腸道菌群的測定結(jié)果（±s，n＝20，CFU/g）Tab 2 Determination results of intestinal microflora in rats of each group（±s，n＝20，CFU/g）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與NAC組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.NAC group，ΔP＜0.05

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4 討論

慢性應(yīng)激是打破了機體本來存在的促炎與抗炎反應(yīng)的平衡，迫使機體反饋性地處于免疫抑制狀態(tài)，表現(xiàn)在促炎因子水平的增加，如IL-1β、IL-6和TNF-α等。慢性應(yīng)激可維持過度的促炎反應(yīng)，誘發(fā)全身的炎癥反應(yīng)，TNF-α與IL-1β可直接刺激并激活炎癥細(xì)胞，如IL-6和血小板活化因子等大量分泌，觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，炎癥細(xì)胞又可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得白細(xì)胞聚集在炎性部位，激活中性粒細(xì)胞參與炎癥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起微循環(huán)障礙，臨床表現(xiàn)為興趣和活動降低，嚴(yán)重者可致休克或死亡[5-6]。INF-γ作為效應(yīng)性的細(xì)胞因子，具有增強中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抑制微生物的活性，慢性應(yīng)激大鼠體內(nèi)INF-γ水平增加也提示了T細(xì)胞參與炎癥過程[7]。機體為控制炎癥反應(yīng)的規(guī)模，免疫系統(tǒng)會釋放IL-4與IL-10等炎細(xì)胞因子代償性抗炎，適度地抗炎可達到保護機體的作用，但持續(xù)性地抗炎可抑制免疫，使機體防御反應(yīng)持續(xù)下調(diào)，反饋性地促進感染，影響預(yù)后[8-9]。本文結(jié)果顯示，與模型組比較，NAC組和川芎嗪+NAC組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ水平均降低。其中NAC減少炎癥因子的機制較復(fù)雜，如清除自由基增加機體抗氧化應(yīng)激能力、與谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）結(jié)合分解清除過氧化物、降低脂質(zhì)過氧化物水平、阻止核因子κB（NF-κB）通路激活、抑制促炎細(xì)胞因子等。與NAC比較，川芎嗪的抗炎作用多為直接途徑，如川芎嗪可直接抑制TNF-α表達，且可抑制TNF-α引起的細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）表達，減少白細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集，達到保護內(nèi)皮細(xì)胞的目的。另外，川芎嗪還可調(diào)控和穩(wěn)定代謝多種細(xì)胞因子及構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)失常狀態(tài)，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物表達，如丙二醛（MDA）。川芎嗪聯(lián)合NAC治療慢性應(yīng)激的機制可能是通過抑制活性氧激活、減輕氧化損傷、降低炎癥因子水平，進而改善慢性應(yīng)激程度。

多種腸道微菌構(gòu)成了復(fù)雜而又動態(tài)平衡的腸道微生態(tài)。本文采用束縛、游泳和噪音等3種刺激方式成功制備了慢性應(yīng)激大鼠模型，大鼠的腸道菌群平衡被破壞，表現(xiàn)在有害菌的數(shù)量增加和有益菌的數(shù)量減少，前者如大腸埃希菌與腸球菌，后者如乳桿菌與雙歧桿菌，提示3種慢性刺激影響了大鼠消化道功能[10-11]。NAC可直接降低十二指腸與回腸黏膜中IL-2、IL-6與前列腺素E2（PGE2）表達，降低空腸黏膜IL-2和PGE2，提高十二指腸黏膜GSH-Px活性，達到抑制腸道免疫應(yīng)激的目的[12]。川芎嗪通過改善微循環(huán)、抗缺血缺氧和抗氧自由基等多種作用改善胃腸黏膜微循環(huán)，抑制氧自由基生成，維護腸道屏障功能[13]。川芎嗪與NAC聯(lián)用可明顯增強慢性應(yīng)激大鼠腸道微生態(tài)的改善效果。

綜上，慢性應(yīng)激可明顯增加外周促炎細(xì)胞因子和改變腸道微生態(tài)；川芎嗪聯(lián)合NAC可通過降低促炎細(xì)胞因子水平和改善腸道微生態(tài)狀態(tài)從而改善慢性應(yīng)激狀態(tài)，但兩藥聯(lián)用增效的機制有待進一步研究。

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Effects of Ligustrazine Combined with N-acetylcysteine on Peripheral Pro-inflammatory Cytokines and Intestinal Microflora of Chronic Stress Rat

WANG Ying（Dept.of Oncology，the East Ward，Sichuan Academy of Medical Science/Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610075，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of ligustrazine combined with N-acetylcysteine（NAC）on the peripheral proinflammatory cytokines and intestinal microflora of chronic stress rat.METHODS：Normal rats were included in normal control group，and chronic stress model rats were divided into model group，NAC group（60 mg/kg）and ligustrazine+NAC group（15 mg/kg+60 mg/kg），with 20 rats in each group.They were given relevant medicine intragastrically for 15 d.The general inspection of rats were recorded in each group.Level of IL-6，IL-1β，TNF-α and INF-γ in serum were detected，and intestinal microflora was measured.RESULTS：Compared with normal control group，chronic stress symptom of rats were found in model group，and level of IL-6，IL-1β，TNF-α and INF-γ in serum were enhanced；Escherichia coliandEnterococcusin intestine were increased，whileBacterium lacticumandBacillus bifiduswere decreased（P＜0.05）.Compared with model group，chronic stress symptom of rats were relieved in NAC group and ligustrazine+NAC group，and above indexes were all improved（P＜0.05）；ligustrazine+NAC group was better than NAC group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Ligustrazine+NAC can improve chronic stress of rats by decreasing pro-inflammatory cytokines and improving the intestinal microflora.

Ligustrazine；N-acetylcysteine；Chronic stress；Rat；Pro-inflammatory cytokines；Intestinal microflora

R378；R285

A

1001-0408（2017）04-0476-03

2016-05-28

2016-10-06）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81402402）

＊主治醫(yī)師，博士。研究方向：惡性腫瘤靶向治療的基礎(chǔ)及臨床。電話：028-87393927。E-mail：201178967@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.12