非典型溶血尿毒綜合征患兒14例臨床表型與基因型分析

王春燕 沈 茜 孫 利 李國民 吳冰冰 徐 虹

·論著·

非典型溶血尿毒綜合征患兒14例臨床表型與基因型分析

王春燕1沈 茜1孫 利2李國民2吳冰冰3徐 虹1

目的 對非典型溶血尿毒綜合征(aHUS)臨床表型和基因型分析了解與預(yù)后的關(guān)系。方法 納入臨床表現(xiàn)符合血栓性微血管病(TMA)的患兒，通過ELISA法行ADAMTS13酶活性的檢測，對ADAMTS13酶活性>10%，且排除其他類型HUS，行腎臟267個基因panel(包括aHUS已知的與發(fā)病相關(guān)的C3、C4、C5、CFH、CFB、CFI、MCP、CFHR1、CFHR3、CFHR5、THBD、PLG、DGKE)二代測序，對測序結(jié)果陽性的基因行sanger驗(yàn)證。提取納入的aHUS患兒的隨訪資料，比較基因突變與未突變患兒預(yù)后，系統(tǒng)檢索文獻(xiàn)，行aHUS臨床表型與基因文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。結(jié)果 14例aHUS患兒進(jìn)入本文分析，男6例，女8例，5例累及腎臟以外系統(tǒng)?；驒z測陽性和陰性者SCr分別為335.3和247.8，eGFR分別為28.8和21.2，C3降低分別為3例和4例，隨訪時間1～67個月，末次隨訪結(jié)局：基因檢測陽性和陰性死亡分別為2例和0例，復(fù)發(fā)分別為2例和0例，終末期腎病(ESRD)分別為3例和0例，eGFR分別為48和103.7。檢索Pubmed數(shù)據(jù)庫，對包括本文病例在內(nèi)的成人(148例)和兒童(154例)aHUS病例行臨床特征和基因型分析，男性病例兒童多于成人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；前驅(qū)感染(消化和呼吸道)兒童較成人比例高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除神經(jīng)系統(tǒng)受累、肺泡內(nèi)出血及高血壓外，兒童較成人更易累及其他系統(tǒng)(肝炎、胰腺炎等多器官受損)；成人Scr異常高值大于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CFH突變率歐洲人群高于亞洲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 兒童和成人CFH突變均較未突變的aHUS病例預(yù)后差，兒童較成人aHUS病例更易累及腎臟、神經(jīng)以外的系統(tǒng)。

非典型溶血尿毒綜合征； 兒童； 臨床表型； 基因

非典型溶血尿毒綜合征(aHUS)是一類罕見疾病，臨床主要表現(xiàn)為微血管溶血性貧血、血小板減少、急性腎臟功能受損，是導(dǎo)致兒童急性腎衰竭的常見原因，預(yù)后差，文獻(xiàn)報(bào)道約25%的aHUS患者急性期死亡，50%的aHUS患者進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)[1]。遺傳因素在aHUS的發(fā)病中起重要作用。本文前瞻性地收集復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)確診的aHUS病歷，采集臨床表型、分子遺傳學(xué)信息和隨訪結(jié)局，并檢索國內(nèi)外aHUS文獻(xiàn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)。

1 方法

1.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 我院2013年以來初步建立了aHUS診斷和病因?qū)W研究的流程：①aHUS診斷符合以下標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)病年齡<18歲；存在微血管性溶血性貧血、血小板減少和器官損害(主要為腎臟損害)； ADAMTS13酶活性>10%。②符合aHUS診斷病例行二代測序明確發(fā)病原因。③排除典型的HUS和肺炎鏈球菌相關(guān)性HUS等。至2016年12月前在我院完成aHUS診斷和病因?qū)W研究流程的連續(xù)病例。

1.2 病例信息采集 采集人口學(xué)資料(性別、發(fā)病年齡等)，臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查(腎功能、LDH、補(bǔ)體C3、ADAMTS13酶活性)，連續(xù)隨訪情況和aHUS二代測序結(jié)果。

1.3 ADAMTS13酶活性檢測 血漿治療前抽取外周血2mL,枸櫞酸鈉抗凝，3 000 rpm離心，抽取上層血漿，行ELISA法(Technoclone ADAMTS-13 activity ELISA kit)檢測。

1.4 隨訪中相關(guān)預(yù)后定義 ①急性腎衰竭：48 h內(nèi)血肌酐(SCr) ≥26 μmol·L-1(0.3 mg·dL-1)或≥基線的1.5倍; ②ESRD:eGFR <15 mL·min-1·1.73 m-2或需要進(jìn)行透析的患兒；③貧血：Hb<120 g·L-1(年齡4～6個月<100 g·L-1)；④PLT減少：PLT<150×109·L-1; ⑤少尿：24 h尿量<400 mL;⑥高血壓:3次血壓測定平均收縮壓和或舒張壓≥同年齡、同性別及同身高的血壓的P95。

1.5 aHUS 二代測序

1.5.1 測序方法 取得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意，抽取患兒外周靜脈血2 mL,EDTA抗凝，應(yīng)用QIAGEN試劑盒(Qiagen Inc.,Valencia,Calif.,USA)提取基因組DNA并測定其濃度。行腎臟267個基因panel的二代測序，panel中包括目前已經(jīng)報(bào)道的與aHUS發(fā)病相關(guān)基因C3 、MCP、CFB、CFH、CFHR1、CFHR2 、CFHR3、CFHR4 、CFHR5、CFI、C5、THBD、DGKE和PLG，對測序結(jié)果為陽性的患兒進(jìn)行Sanger法驗(yàn)證。

1.5.2 測序結(jié)果分析 對測序結(jié)果陽性的aHUS患兒,查詢HGMD(human gene mutation database)了解相關(guān)突變的致病性，在千人基因庫( http://www.1000genomes.org/data)及Exac Broswer(http://exac.broadinstitute.org/)中查詢突變的等位基因頻率，通過 SIFT(http://sift.jcvi.org)及PolyPhen2.0 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/dbsearch.shtmL)、 provean(http://provean.jcvi.org/index.php)和Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)進(jìn)行其致病性預(yù)測，判斷突變位點(diǎn)致病情況。

1.6 文獻(xiàn)檢索和排除原則 以(mutation AND aHUS OR mutation AND "Atypical Hemolytic Uremic Syndrome")為檢索式檢索PubMed數(shù)據(jù)庫，以“突變”AND“aHUS”O(jiān)R“非典型溶血尿毒綜合征”為檢索式，檢索萬方和中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫。排除二次文獻(xiàn)、評論、講座和單個病例報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 aHUS患兒臨床和遺傳特點(diǎn) 14例aHUS患兒進(jìn)入本文分析，男6例，女8例，發(fā)病年齡(3.6±2.7)歲。表1顯示，發(fā)病前4例有上呼吸道感染病史，2例有腹瀉病史,均無明確的家族史，少尿6例，高血壓7例，CNS受累4例，心臟和肺受累1例，B超均提示雙腎腫脹損害，結(jié)構(gòu)不清。基因檢測陽性9例。

表1顯示，依照基因檢測陽性和陰性的結(jié)果，①實(shí)驗(yàn)室檢查：SCr(μmol·L-1)分別為335.3和247.8，eGFR(mL·min-1·1.73 m-2)分別為28.8和21.2，Hb(g·L-1)分別為76.6和83.5，PLT(109·L-1)分別為54.3和98.0。C3降低分別為3例和4例，蛋白尿+分別為3例和2例，高血壓分別為6例和1例；②均進(jìn)行定期隨訪，隨訪時間1～67個月，末次隨訪結(jié)局：基因檢測陽性和陰性病死分別為2例和0例，復(fù)發(fā)分別為2例和0例，CKD-I分別為1例，ESRD分別為3例(1例目前為腎移植后2月，2例目前腹膜透析中)和0例，蛋白尿分別為1例和2例，eGFR(mL·min-1·1.73 m-2)分別為48和103.7。

表2顯示，9例基因檢測陽性，CFH、CFI雜合突變分別為3例和1例，MCP、CFHR1純合突變各1例，CFHR1基因3-5號外顯子雜合缺失1例，同時有CFB和C3基因的雜合突變1例，CFH基因20號外顯子重復(fù)及CFHR1基因4號外顯子缺失1例。3個位點(diǎn)(C3 ，c.21G>A；CFH，IVS8+4A>G；CFI，c.772+1G>T)為新發(fā)突變。

2.2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí) Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索到5篇[4～8]符合本文aHUS納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)，分別來自于美國[4]、意大利[5]、韓國[6]、中國[7]、法國[8]，其中美國文獻(xiàn)[4](144例)不能拆分成人和兒童病例，未詳細(xì)提供臨床數(shù)據(jù)，提供了基因檢測結(jié)果；法國文獻(xiàn)[8]成人125例，兒童89例，分別提供了臨床數(shù)據(jù)和基因檢測結(jié)果；意大利文獻(xiàn)[5]成人104例，兒童169例，未分別提供臨床數(shù)據(jù)和基因檢測結(jié)果；韓國文獻(xiàn)[6]為51例兒童aHUS病例，中國文獻(xiàn)[7]為23例成人aHUS病例，均提供臨床數(shù)據(jù)和基因檢測結(jié)果。表3匯總了包括本文報(bào)告的14例在內(nèi)的兒童和成人aHUS病例臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，男性病例兒童多于成人、前驅(qū)感染(消化和呼吸道)兒童較成人比例高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除神經(jīng)系統(tǒng)受累、肺泡內(nèi)出血及高血壓外，兒童較成人更易累及其他系統(tǒng)(肝炎、胰腺炎、多器官受損)；成人Scr異常高值大于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 14例非典型溶血尿毒綜合征患兒臨床特征及隨訪結(jié)果

注 Hb：g·L-1；PLT×109·L-1; Scr:mmol·L-1; eGFR:mL·min-1·1.73 m-2，CKD-Ⅰ：慢性腎臟病Ⅰ期，上感：上呼吸道感染

表2 9例非典型溶血尿毒綜合征患兒基因檢測結(jié)果

注CFH：補(bǔ)體因子H：CFB：補(bǔ)體因子B；MCP：膜結(jié)合蛋白；MAF：最小等位基因頻率； NA：未見報(bào)道

本文將美國[4]、法國[8]、意大利[5]文獻(xiàn)中的研究人群作為歐洲人群，將韓國[6]、中國[7]文獻(xiàn)中的研究人群作為亞洲人群，行不同基因的突變頻率進(jìn)行比較。表4顯示，歐洲人群CFH突變率高于亞洲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余其他基因突變頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

匯總成人隨訪結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)完整的法國[8]和意大利[5]文獻(xiàn)，圖1顯示，不同基因突變較未突變患者死亡和ESRD風(fēng)險增加了1.2倍；CFH和CFI基因突變較未突變患者死亡和ESRD風(fēng)險分別增加了1.6倍和1.4倍；MCP基因突變較未突變者死亡和ESRD風(fēng)險降低了55%。圖2顯示，不同基因突變較未突變患者復(fù)發(fā)風(fēng)險增加了1.8倍；CFH、MCP和CFI基因突變較未突變患者復(fù)發(fā)風(fēng)險分別增加了1.7倍、2.7倍和2.1倍。匯總兒童隨訪結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)完整的法國[8]和韓國[6]文獻(xiàn)，圖3顯示，不同基因突變較未突變患者死亡和ESRD風(fēng)險差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CFH基因突變較未突變患兒死亡和ESRD風(fēng)險分別增加了1.8倍；MCP基因突變較未突變患者死亡和ESRD風(fēng)險降低了68%。

表3 已報(bào)道的非典型溶血尿毒綜合征患兒的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查

表4 歐洲與亞洲的aHUS患者不同基因突變比例比較[n(%)]

圖1 不同基因突變與無基因突變患者進(jìn)展為ESRD和死亡比較

圖2 不同基因突變與無基因突變患者復(fù)發(fā)的比較

圖3 不同基因突變與無基因突變患兒死亡和ESRD的比較

3 討論

aHUS為TMA中的一種疾病，發(fā)病率為0.4/100 000～6/100 000，臨床主要表現(xiàn)為微血管溶血性貧血、血小板減少及腎功能受損[9]，起病急，預(yù)后差，臨床表現(xiàn)與血栓性血小板減少性紫癜(TTP)不易鑒別，既往通過臨床是否有神經(jīng)系統(tǒng)受累與TTP進(jìn)行鑒別，本研究14例患兒中4例累及神經(jīng)系統(tǒng)，但ADAMTS13酶活性正常，因此，ADAMTS13酶活性檢測對臨床診斷及鑒別診斷極其重要，14例aHUS患兒中9例(64.3%)遺傳學(xué)檢測陽性，說明遺傳因素在其發(fā)病中起重要作用，9例遺傳學(xué)檢測陽性患兒中CFH突變比例高(33.3%)，且預(yù)后差，2例死亡，1例為ESRD，與本文文獻(xiàn)復(fù)習(xí)結(jié)果一致， 14例aHUS患兒隨訪結(jié)果顯示，基因突變較未基因突變的腎功能差，進(jìn)一步說明對aHUS患兒行遺傳學(xué)檢測對判斷其長期預(yù)后極其重要。

本研究通過對aHUS的臨床與分子遺傳學(xué)的研究，總結(jié)TMA的診斷與鑒別診斷流程(圖4)，對臨床診斷為TMA的患者，均應(yīng)行ADAMTS13酶活性檢測，對 ADAMTS13酶活性<10%診斷為TTP[10]，并行抗-ADAMTS13抗體和基因檢測，進(jìn)一步行TTP分型，相關(guān)分析見文獻(xiàn)[11]，不再贅述。ADAMTS13酶活性≥10%的患兒，診斷為HUS，結(jié)合臨床病史及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)一步進(jìn)行分型[12～14]，有器官移植、惡性腫瘤等病史可診斷為繼發(fā)性HUS，肺炎鏈球菌檢測陽性可診斷為肺炎鏈球菌相關(guān)性HUS，血尿串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果示甲基丙二酸升高者，需考慮是否為VB12缺乏引起的HUS，并進(jìn)一步行與其發(fā)病相關(guān)的MMACHC基因檢測加以確診，糞大腸埃希菌O157∶H7培養(yǎng)陽性，結(jié)合其發(fā)病前期明顯腹瀉病史，可診斷HUS，排除以上致病因素，則可診斷為aHUS，行全基因組測序或aHUS已知致病基因測序，進(jìn)一步明確aHUS病因[15,16]。

圖4 血栓性微血管病臨床與實(shí)驗(yàn)室診斷流程

通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，比較成人與兒童aHUS患者臨床數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，提示成人aHUS患者中女性較多，可能與妊娠是成人aHUS較常見的誘因相關(guān)，兒童較成人易出現(xiàn)肝臟、胰腺及多器官累及[4～8]，提示兒童急性期臨床表現(xiàn)較成人重，需積極干預(yù)，減少急性期病死率。比較歐洲與亞洲aHUS患者不同基因突變頻率，提示歐洲aHUS患者中CFH突變頻率高于亞洲，可能與歐洲與亞洲aHUS人群遺傳背景不同相關(guān)，余基因突變頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本庫較小且其所占的比例較少相關(guān)。

總體而言，基因突變較未突變的aHUS患者死亡和ESRD風(fēng)險增加； 成人和兒童aHUS中，CFH基因突變較未突變者死亡、ESRD和復(fù)發(fā)風(fēng)險均升高，MCP基因突變較未突變者死亡和ESRD風(fēng)險降低。

隨著對aHUS發(fā)病機(jī)制的深入研究，其治療也取得了突破性進(jìn)展。Eculizumab為C5的單抗，可以特異性阻斷補(bǔ)體通路的激活，研究發(fā)現(xiàn)Eculizimab可以明顯長期改善aHUS患兒腎功能， 2011年由FDA批準(zhǔn)為aHUS患兒治療藥物， Eculizimab目前主要用于補(bǔ)體替代途徑相關(guān)基因突變引起的aHUS[17，18]，但我國目前無此藥上市。

[1] Noris M,Remuzzi G.Atypical hemolytic-uremic syndrome.N Engl J Med,2009,361(17):1676-1687

[2] Loirat C,Noris M,Fremeaux-Bacchi V.Complement and the atypical hemolytic uremic syndrome.Pediatr Nephrol,2008,23(11):1957-1972

[3] Lemaire M,Frémeaux-Bacchi V,Schaefer F,et al.Recessive mutations in DGKE cause atypical hemolytic-uremic syndrome.Nature Genetics,2013,45(5):531-536

[4] Maga TK,Nishimura CJ,Weaver AE,et al.Mutations in alternative pathway complement proteins in American patients with atypical hemolytic uremic syndrome.Hum Mutat,2010,31(6):E1445-1460

[5] Noris M,Caprioli J,Bresin E,et al.Relative role of genetic complement abnormalities in sporadic and familial aHUS and their impact on clinical phenotype.Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(10):1844-1859

[6] Lee JM,Park YS,Lee JH,et al.Atypical hemolytic uremic syndrome:Korean pediatric series.Pediatr Int,2015,57(3):431-438

[7] Zhang T,Lu J,Liang S,et al.Comprehensive Analysis of Complement Genes in Patients with Atypical Hemolytic Uremic Syndrome.Am J Nephrol,2016,43(3):160-169

[8] Fremeaux-Bacchi V,Fakhouri F,Garnier A,et al.Genetics and outcome of atypical hemolytic uremic syndrome:a nationwide French series comparing children and adults.Clin J Am Soc Nephrol,2013,8(4):554-562

[9] Rodríguez de Córdoba S,Hidalgo MS,Pinto S,et al.Genetics of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS).Semin Thromb Hemost,2014,40(4):422-430

[10] Blombery P,Kivivali L,Pepperell D,et al.Diagnosis and management of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) in Australia:findings from the first 5 years of the Australian TTP/thrombotic microangiopathy registry.Intern Med J,2016,46(1):71-79

[11] 王春燕,童桂霞,孫利,等.兒童繼發(fā)性血栓性血小板減少性紫癜1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí).中國循證兒科雜志,2016,11(5):388-391

[12] Ariceta G,Besbas N,Johnson S,et al.Guideline for the investigation and initial therapy of diarrhea-negative hemolytic uremic syndrome.Pediatr Nephrol,2009,24(4):687-696

[13] Antonia B,Gajja S,Jaap G,et al.Cd46-Associated Atypical Hus with Uncommon Course Caused by Mutations in the Cblc Mmachc Gene.Pediatr Transplant,2011,15(s1):78

[14] Vieira-Martins P,El Sissy C,Bordereau P,et al.Defining the genetics of thrombotic microangiopathies.Transfus Apher Sci,2016,54(2):212-219

[15] Scully M.Thrombotic Thrombocytopenic Purpura and Atypical Hemolytic Uremic Syndrome Microangiopathy in Pregnancy.Semin Thromb Hemost,2016,42(7):774-779

[16] Loupiac A,Elayan A,Cailliez M,et al.Diagnosis of Streptococcus pneumoniae-associated Hemolytic Uremic Syndrome.Pediatr Infect Dis J,2013,32(10):1045-1049

[17] Bedrosian,C.,et al.Eculizumab is effective in patients resistant to plasma exchange/infusion with atypical hemolytic uremic syndrome (AHUS).Journal of Thrombosis and Haemostasis,2011,9:651-652

[18] Chatelet V,Frémeaux-Bacchi V,Lobbedez T,et al.Safety and long-term efficacy of eculizumab in a renal transplant patient with recurrent atypical hemolytic-uremic syndrome.Am J Transplant,2009,9(11):2644-2645

(本文編輯：張崇凡，孫晉楓)

Analysis of genotype-phenotype correlation in 14 patients with atypical hemolytic uremic syndrome

WANGChun-yan1,SHENQian1,SUNLi2,LIGuo-min2,WUBing-bing3,XUHong1

(1DepartmentofNephrology,ShanghaiKidneyDevelopment&PediatricKidneyDiseaseResearchCenter,2DepartmentofRheumatology,3MedicalTranslationalCenter，Children'sHospitalofFudanUniversity，Shanghai201102,China)

XU Hong,E-mail:hxu@shmu.edu.cn

Objective To investigate the relationship between the genotype and long-term progress in atypical hemolytic uremic syndrome.MethodsPatients diagnosed with thrombotic microangiopathy were included and examined for ADAMTS13 activity.The patients whose ADAMTS13 activity was above 10% were screened for mutations in 267 kidney disease related genes using next generation sequencing.The mutations were confirmed using the Sanger sequencing.The patients were grouped according to their genetic characteristics and compared for the long-term progress.The literatures of aHUS genotype-phenotype were reviewed.ResultsFourteen patients were included in our study,Other organs were involved in 5 patients.9 of 14 patients (64.3%) were reported with at least one mutation.Heterozygous mutations were found in 3 cases and one case inCFHandCFIgenes respectively.One patien was identified with homozygous mutation onMCP,one patient with homozygous mutation onCFHR1 ,one with exon 3-5 deletion of theCFHR1,one with combined mutation ofC3 andCFB,one with combinedCFHexon 20 duplication and exon 4 deletion ofCFHR1.Three novel mutations were identified,C3 (c.21G>A),CFH(IVS8+4A>G) andCFI(c.772+1G>T).Comparing the clinical features of mutation carriers and non-carriers,the mutation carrier's kidneys involved the eGFR (mL·min-1·1.73 m-2)were 28.8 and 21.2,respectively,lowC3 was found in 4 patients and 3 patients,respectively.During the follow-up for 1-67 months,clinical outcomes varied in mutation-carrier patients,one died during the acute stage and 3 patients progressed to end stage renal disease.Of 3 ESRD patients,one had received renal transplant,2 experienced recurrence and one died.There were no patient died or progressed to end stage renal disease in mutation non-carrier patients.In literatures,children patients were reported to has a high proportion in trigger events and other organs involvement,ConclusionCFHmutations lead to poor long-term progression in aHUS patients and Other organs are more easily involved in children.

Atypical hemolytic uremic syndrome; Children; Phenotype; Gene

1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 1腎臟科，上海市腎臟發(fā)育和兒童腎臟病研究中心，2 風(fēng)濕科，3 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 上海，201102

徐虹 ，E-mail:hxu@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.01.011

2017-01-03

2017-02-23)