石楠銹孢銹菌重寄生擬盤多毛孢的分離鑒定及抑菌活性

李靖 謝津 李向楠 周稚凡 劉風(fēng)路 陳玉惠

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224）

石楠銹孢銹菌重寄生擬盤多毛孢的分離鑒定及抑菌活性

李靖 謝津 李向楠 周稚凡 劉風(fēng)路 陳玉惠

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224）

重寄生擬盤多毛孢因其特殊生境，可產(chǎn)生區(qū)別于內(nèi)生或病原擬盤多毛孢的次生代謝產(chǎn)物，是有待開發(fā)的真菌資源。為了獲得活性較好的石楠銹孢銹菌重寄生菌，采用組織分離法，從患有銹病的球花石楠葉片上分離純化出3株疑似擬盤多毛孢真菌，它們形態(tài)特征差異明顯，通過回接實驗證實其均為石楠銹孢銹菌的重寄生菌。對3 菌株在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和顯微特征作了描述，并對ITS 序列進行了擴增和序列分析。形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果證實這3 株真菌均為擬盤多毛孢屬真菌。抑菌實驗結(jié)果表明，3株重寄生菌除了對石楠銹孢銹菌的銹孢子有破壞作用外，對其他10種常見植物病原真菌也有一定的抑制作用。

擬盤多毛孢；重寄生；分離鑒定；抑菌活性；石楠銹孢銹菌

擬盤多毛孢屬（Pestalotipsis）真菌在自然界廣泛存在，生活習(xí)性多樣，包括致病、腐生、內(nèi)生、重寄生等［1，2］。既是重要的植物病原菌，又是一類具有經(jīng)濟價值的無性型真菌［3，4］。近年來發(fā)現(xiàn)該屬真菌具有高效產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力，因此受到廣泛關(guān)注［5］。重寄生擬盤多毛孢因其特殊生境，可產(chǎn)生區(qū)別于內(nèi)生或病原擬盤多毛孢的次生代謝產(chǎn)物，前期從茶麃生柱銹菌的重寄生擬盤多毛孢中分離得到多個結(jié)構(gòu)新穎的ambuic acid衍生物和聚酮類化合物，具有較好的抗腫瘤活性和抗細菌活性［6，7］與內(nèi)生擬盤多毛孢的代謝產(chǎn)物有明顯差異［8］。因此，從擬盤多毛孢中提取和篩選新的生物活性物質(zhì)尚有很大的潛力，而重寄生擬盤多毛孢資源的收集是其利用的基礎(chǔ)。

石楠銹孢銹菌（Aecidium pourthiaea）是石楠（Photinia prionophylla）銹病的病原菌，主要危害3年生以下的石楠幼樹及幼苗［9］。目前還未見石楠銹孢銹菌重寄生擬盤多毛孢代謝產(chǎn)物的報道。本研究對石楠銹孢銹菌的重寄生擬盤多毛孢進行分離鑒定和抑菌活性篩選，旨為石楠銹病的生物防治及次生代謝產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及處理 石楠銹孢銹病的病葉于2013年11月采集自西南林業(yè)大學(xué)苗圃。從病葉中，選取銹子器已枯死或表面已被其他真菌覆蓋的葉片若干，放入潔凈的培養(yǎng)皿中保濕約1-2 d。然后進行表面消毒：于75%酒精中漂洗10-15 s，然后用無菌水沖洗3-4次，再用0.1%升汞消毒30 s，用無菌水沖洗3-4次。

1.1.2 常見的10種植物病原真菌 辣椒炭疽病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、小麥雪腐病菌（Typhula incarnate）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Cucumebrium）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、辣椒鐮刀病菌（Fusarium solani）、三七絲核病菌（Verticillium cinnabarium）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、梨黑星病菌（Venturia pyrina）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Vasinfectum）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 將經(jīng)表面消毒的材料上的銹病病斑連同周圍組織用無菌手術(shù)刀切下，切成大小約0.5×0.5 cm的小塊，用無菌鑷子將各小塊置入含有50 mg/L鏈霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，每個平板放置3-4小塊，于25℃下培養(yǎng)。

培養(yǎng)3 d后，注意觀察，及時挑取小塊邊緣長出的菌絲體少許，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，經(jīng)2-3次純化獲得純菌落，并從純菌落上切取小塊，轉(zhuǎn)接到試管中的PDA斜面上，保存，備用。

1.2.2 回接驗證 將患有銹病且無其他雜菌污染的石楠葉片放入潔凈的培養(yǎng)皿中，2-3片葉片/ 皿。每皿分別放入純化所得的真菌的菌絲體（不含培養(yǎng)基），置于葉片的銹子器上，設(shè)置空白對照組。在室溫下，保濕培養(yǎng)7-10 d，觀察接上的菌絲是否萌發(fā)生長并將銹子器覆蓋。撥開菌絲后，挑取銹孢子在顯微鏡下鏡檢，觀察銹孢子的形態(tài)及顏色，并拍照。

將上述葉片銹孢子堆上的菌絲再轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，待菌落長成后，觀察其形態(tài)特征，并與原始菌落的形態(tài)比較，再鏡檢新產(chǎn)孢子的形態(tài)特征與原菌株的孢子比較，以確認覆蓋銹孢子的菌株就是原分離純化的菌株。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)描述 將分離純化的菌株分別接種在PDA、改良Fries和理查培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)直至產(chǎn)孢，進行培養(yǎng)性狀和顯微特征的觀察、描述。

1.2.3.2 分子鑒定 采用SK8259（真菌）試劑盒進行DNA的提取，按照試劑盒的說明進行操作。用通用引物ITS4和ITS5擴增ITS序列：ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT-3'），ITS5（5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG-3'）。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收所需DNA目的條帶，純化方式見說明書（SK8131）。

回收產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)Bioedit等軟件分析和手工校正后，用BLAST軟件在GenBank（http://www.ncbi.nlm. nih. gov/BLAST）中進行同源性比較分析，初步確定它們與已知基因的同源關(guān)系。

1.2.4 抑菌活性 采用濾紙片法［10］測定3株菌粗提物的抑菌活性。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離純化

從患銹病的石楠葉片上分離得到分離純化出3株疑似擬盤多毛孢真菌，編號分別為PG52、PG53、PG90。

2.2 三株真菌處理銹孢子的結(jié)果

3株真菌的菌絲體接在石楠葉銹菌的銹子器上保濕培養(yǎng)一段時間后，均能在銹子器上生長，并覆蓋銹子器（圖1）。對菌絲覆蓋的銹孢子鏡檢后發(fā)現(xiàn)，銹孢子的內(nèi)含物明顯濃縮，大部分完全成了空殼（圖2）。

圖1 三株真菌在石楠銹孢銹菌上的生長

圖2 三菌株處理后的銹孢子顯微特征

2.3 三株真菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)描述

2.3.1 菌株P(guān)G52培養(yǎng)性狀 PDA培養(yǎng)基上的菌落白色，絨絮狀，放射狀生長，環(huán)紋不明顯；背面菌落略呈粉色，呈放射狀，培養(yǎng)基平板不變色（圖3-A1，A2）。改良Fries培養(yǎng)基上的菌落白色，厚，絨狀，環(huán)紋明顯；背面棕色至褐色，環(huán)紋和放射狀明顯；培養(yǎng)基平板不變色（圖3-B1，B2）。理查培養(yǎng)基上的菌落白色，絨狀，環(huán)紋明顯；背面粉色，有環(huán)紋；培養(yǎng)基平板不變色（圖3-C1，C2）。

產(chǎn)孢時，PDA培養(yǎng)基上菌落白色，環(huán)紋尤為明顯，黑色墨汁狀孢子團稀少；背面淺棕色，環(huán)紋明顯；培養(yǎng)基平板不變色（圖3-D1，D2）。

菌株P(guān)G52顯微特征（圖3-E）：分生孢子梭形，直或微彎，大小為（25.0-30.0 μm×5.0-6.5 μm）；5個細胞中，三色胞長16.0-19.0 μm，同色或異色，異色者，中間色胞色深，呈棕色，前后兩色胞同色；頂端附屬絲2-3根，先端無勺狀膨大，不分支，長9.5-13.5 μm；基部柄長可達6.5 μm。

2.3.2 菌株P(guān)G53培養(yǎng)性狀 PDA培養(yǎng)基上的菌落淺粉灰色，平鋪于平板，呈放射狀，氣生菌絲不發(fā)達，無環(huán)紋；背面中部為淺棕色，明顯呈放射狀，周圍菌絲體白色；培養(yǎng)基平板不變色（圖4-A1，A2）。改良Fries培養(yǎng)基上的菌落較緊密，中部白色，邊緣一圈棕色，下面似有暗褐色色素沉著，略有環(huán)紋；背面菌落中部白色，由外向內(nèi)漸變褐色、暗褐色，邊緣棕色，環(huán)紋明顯；培養(yǎng)基平板不變色（圖4-B1，B2）。理查培養(yǎng)基上的菌落中部白色，邊緣淺褐色，氣生菌絲不發(fā)達，大部分平鋪于平板上，僅中部成稀疏絮狀；背面棕色，呈放射狀；培養(yǎng)基平板不變色（圖4-C1，C2）。

圖3 菌株P(guān)G52培養(yǎng)性狀和孢子顯微特征

產(chǎn)孢時，PDA培養(yǎng)基上，菌落平鋪于平板，氣生菌絲不發(fā)達，菌絲體有白色和棕色兩種，棕色的放射狀尤為明顯，黑色孢子團多出現(xiàn)在白色菌落上，呈顆粒狀，小而密聚；背面棕色、淺褐色，呈放射狀，有大量密集的黑點，且呈環(huán)狀排列；培養(yǎng)基平板不變色（圖4-D1，D2）。

菌株P(guān)G53顯微特征（圖4-E），分生孢子梭形，直或微彎，大小為24.0-31.0×5.0-7.5 μm，5個細胞中，三色胞長15.5-19.0 μm，異色，前二色胞顏色深于第三色胞，尤中間色胞呈棕色；頂端2-3根附屬絲，先端無勺狀膨大，不分支，長12.0-18.0 μm；基部柄長3.0-8.5 μm。

圖4 菌株P(guān)G53培養(yǎng)性狀和孢子顯微特征

2.3.3 菌株P(guān)G90培養(yǎng)性狀 在PDA培養(yǎng)基上，菌落粉白色，絨絮狀，厚，環(huán)紋非常明顯，略呈放射狀，氣生菌絲發(fā)達；背面粉白色，環(huán)紋明顯；培養(yǎng)基平板不變色（圖5-A1，A2）。改良Fries培養(yǎng)基上，菌落絮狀，環(huán)紋不明顯，略呈放射狀生長；背面呈淺棕色，有環(huán)紋，明顯呈放射狀；培養(yǎng)基平板不變色（圖5-B1，B2）。理查培養(yǎng)基上（圖5-C1，C2），菌落白色，絨絮狀，無環(huán)紋；背面略顯粉色，無環(huán)紋；培養(yǎng)基平板不變色。

圖5 菌株P(guān)G90培養(yǎng)性狀和孢子顯微特征

產(chǎn)孢時，PDA培養(yǎng)基上地菌落白色，絨絮狀，黑色墨汁狀的孢子團數(shù)量少分布不均勻；背面淺粉黃色，略呈放射狀；培養(yǎng)基平板不變色（圖5-D1，D2）。

顯微特征（圖5-E），分生孢子梭形，直或微彎，大小為（23.0-31.0）μm×（5.0-6.0）μm，5個細胞中，三色胞長15.5-20.5 μm，異色，最后一個色胞近無色，中間色胞顏色明顯深于第一個色胞，呈褐色；頂端2-4根附屬絲，先端無勺狀膨大，不分支，長10.0-17.5 μm；基部柄長3.0-5.0 μm。

2.4 ITS序列擴增及分析

通過1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，在600 bp左右出現(xiàn)目的條帶。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化、測序，得到如下序列。序列在GenBank中進行同源性比較分析，結(jié)果（圖6）顯示菌株P(guān)G52與Pestalotiopsis vismiae（Accession number FJ481027.1）、Pestalotiop-sis disseminata（Accession number JQ323000.1）、Pestalosphaeria hansenii（Accession number JF4395-05.1）等的ITS序列均有100%的相似性；PG53與Pestalotiopsis neglecta（Accession number JX8545-41.1）、Pestalotiopsis vismiae（Accession number AB-251916.1）、Pestalotiopsis sp.（Accession number JF-773663.1）等的ITS序列均有100%的相似性；PG-90與Pestalotiopsis neglecta（Accession number JX854-541.1）、Pestalotiopsis sp.（Accession number HE608-797.1）、Pestalotiopsis sp.（Accession number JF773-663.1）等的ITS序列均有100%的相似性。根據(jù)序列比對結(jié)果，確定3株菌均屬于擬盤多毛孢屬真菌。

2.5 三株菌的抑菌活性

抑菌結(jié)果（表1、表2）顯示，菌株P(guān)G90的粗提物對番茄灰霉和白菜黑斑沒有活性，對其他8種植物病原菌有微弱的活性；菌株P(guān)G53對番茄灰霉和黃瓜枯萎沒有活性，對棉花枯萎的抑菌圈直徑達到4.6 cm，但是抑菌圈完全不透明；菌株P(guān)G52對番茄灰霉和白菜黑斑無活性，對黃瓜枯萎和小麥雪腐的抑菌圈較小，對其余6種植物病原菌的抑菌圈均超過2 cm，且抑菌圈透明，由此可見菌株P(guān)G52的抑菌活性明顯優(yōu)于其他2個菌株。

3 討論

擬盤多毛孢屬至今已報道220多個種，目前對該屬的分類主要沿襲Guba（1961）的分種方法。但因種間分生孢子等形態(tài)特征過于重疊，許多種之間的界限模糊不清，不同作者的描述相差甚遠［11，12］。為鑒定分離得到的3株重寄生菌，除形態(tài)觀察描述外，還對ITS序列進行了分析，但3個菌株的ITS序列均與3-7個已知種有100%的相似度，因此暫時不能確定種名。今后的研究中，除了測定ITS序列，還將借助其他分子標(biāo)記片段如28S和beta-tubulin基因?qū)M盤多毛孢鑒定到種。

本研究分離獲得的3株重寄生擬盤多毛孢形態(tài)特征差異明顯，對石楠銹孢銹菌的銹孢子有強寄生作用，被作用的銹孢子內(nèi)含物明顯濃縮，大部分成了空殼；對10種常見植物病原真菌有一定抑制作用，本研究為重寄生擬盤多毛孢在銹病生物防治中的應(yīng)用及其次生代謝產(chǎn)物的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖6 PG52、PG53、PG90序列分析

4 結(jié)論

本研究從患有銹病的球花石楠葉片上分離純化出3株擬盤多毛孢真菌，均為石楠銹孢銹菌的重寄生菌。三株重寄生擬盤多毛孢形態(tài)特征差異明顯，對石楠銹孢銹菌的銹孢子均有強寄生作用，被作用的銹孢子內(nèi)含物濃縮，大部分完全成了空殼；同時對十種常見植物病原真菌有一定的抑制作用。

表1 三菌株粗提物對5種植物病原菌的抑菌作用

表2 三菌株粗提物對5種植物病原菌的抑菌作用

［1］Maharachchikumbura SS , Guo LD, Chukeatirote E, et al. Pestalotiopsis-morphology, phylogeny, biochemistry and diversity［J］. Fungal Diversity, 2011, 50（1）：167-187.

［2］Hopkins KE, Mcquilken MP. Characteristics of Pestalotiopsis associated with hardy ornamental plants in the UK［J］. European Journal of Plant Pathology. 2000, 106：77-85.

［3］Taylor JE, Crous PW, Palm ME. Foliar and stem fungal pathogens of Proteaceae in Hawaii［J］. Mycotaxon, 2001, 78：449-490.

［4］Keith LM, Velasquez ME, Zee FT. The relationship between an endangered North American tree and an endophytic fungus［J］. Plant Disease, 2006, 90：16-23.

［5］Xu J, Ebada SS, Proksch P. Pestalotiopsis a highly creative genus：chemistry and bioactivity of secondary metabolites［J］. Fungal Diversity, 2010, 44（1）：15-31.

［6］Li J, Xie J, Yang YH, et al. Pestalpolyols A-D, cytotoxic polyketides from Pestalotiopsis sp. cr013［J］. Planta Medica, 2015, 81：1285-1289.

［7］Xie J, Li J, Yang YH, et al. Two new ambuic acid analogs from Pestalotiopsis sp. cr013［J］. Phytochemistry Letters, 2014, 10：291-294.

［8］白志強, 林秀萍, 劉永宏. 內(nèi)生擬盤多毛孢菌化學(xué)成分研究進展［J］. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25：706-715.

［9］ 蔡燦, 伍建榕. 球花石楠銹病病原物的初步研究［J］. 北方園藝, 2008（1）：208-210.

［10］李向楠, 周稚凡, 劉風(fēng)路, 等. 云南榧種子內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌活性篩選［J］. 生物災(zāi)害科學(xué), 2016, 39（1）：20-26.

［11］韋繼光, 徐同, 廖旺姣, 等. 擬盤多毛孢屬的分類學(xué)研究進展［J］. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 2006, 25（1）：78-85.

［12］韋繼光, 徐同. 植物內(nèi)生擬盤多毛孢的生物多樣性［J］. 生物多樣性, 2003, 11（2）：162-168.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation，Identification and Antimicrobial Activity of Mycoparasites（Pestalotiopsis）from Aecidium pourthiaea

LI Jing XIE Jin LI Xiang-nan ZHOU Zhi-fan LIU Feng-lu CHEN Yu-hui
（Life Science College，Southwest Forestry University，Kunming 650224）

Mycoparasite Pestalotiopsis produces the second metabolites different from endophytic or pathogenic Pestalotiopsis，as an important fungal resource，is yet to be developed and used. In order to obtain highly active mycoparasites of Aecidium pourthiaea，tissue separation method was used to isolate the mycoparasites，and 3 strains were isolated from the leaves of Photinia prionophylla with rust and suspected to be Pestalotiopsis；moreover，they were confirmed to be mycoparasites of A. pourthiaea via the tie back experiments though their morphologies varied obviously. Cultural characteristics on different medium and microscopic features of these three strains were described；also ITS sequences were amplified and analyzed. The morphology and molecular identification confirmed that all 3 strains were Pestalotiopsis. The results of anti-fungus experiment showed that these three strains not only destroyed the aecidiospores of A. pourthiaea，but also inhibited the growth of other 10 plant pathogenic fungi.

Pestalotiopsis；mycoparasite；isolation and identification；antimicrobial activity；Aecidium pourthiaea

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.018

2016-11-10

云南省優(yōu)勢特色重點學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項目（50097505），云南省高校林下生物資源保護及利用科技創(chuàng)新團隊項目（51400605）

李靖，女，博士，副教授，研究方向：微生物生理生化；E-mail：lijingcas@163.com

陳玉惠，博士，教授，研究方向：資源微生物收集及利用；E-mail：chenyuhui@swfu.edu.cn