人抗酶抑制因子-1的原核表達(dá)純化及多克隆抗體的制備

呂亞豐 楊建林 秦宇 王艷林

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002）

人抗酶抑制因子-1的原核表達(dá)純化及多克隆抗體的制備

呂亞豐 楊建林 秦宇 王艷林

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002）

原核表達(dá)純化人抗酶抑制因子-1（（antizyme inhibition factor-1，AZIN1），制備并鑒定抗AZIN1多克隆抗體。pET-28a/AZIN1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用Ni-NTA 樹脂于變性條件下親和層析純化人AZIN1蛋白。將重組AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)抗AZIN1抗體效價(jià)，Western bloting、細(xì)胞免疫熒光、細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)抗體的應(yīng)用。結(jié)果顯示，重組pET-28a/AZIN1表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定構(gòu)建正確。細(xì)菌內(nèi)重組AZIN1蛋白可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并以包涵體的形式存在。用親和層析法能有效純化原核表達(dá)的AZIN1蛋白，該蛋白在小鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)抗AZIN1特異性抗體產(chǎn)生，血清效價(jià)達(dá)到1∶640 000。制備抗體能夠特異性識(shí)別和結(jié)合人及小鼠瘤細(xì)胞中表達(dá)的AZIN1蛋白，并可有效用于AZIN1的Western blotting、細(xì)胞免疫熒光和細(xì)胞免疫化學(xué)分析。成功原核表達(dá)和純化了人AZIN1蛋白并制備了抗AZIN1多克隆抗體，為深入研究AZIN1在調(diào)控細(xì)胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基礎(chǔ)。

抗酶抑制因子；原核表達(dá)；抗體

多胺（腐胺、精脒和精胺）是一類帶正電荷的烷基類小分子化合物，廣泛存在于真核細(xì)胞并參與細(xì)胞的增值、分化及凋亡等重要的生理過程，其在細(xì)胞內(nèi)的合成、分解及攝取受到嚴(yán)密的調(diào)控以維持體內(nèi)的多胺代謝穩(wěn)衡［1，2］?？姑敢种埔蜃?1（antizyme inhibition factor-1，AZIN1）是細(xì)胞內(nèi)參與多胺代謝調(diào)節(jié)的重要蛋白因子，它通過與鳥氨酸脫羧酶抗酶（Ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）結(jié)合而解除后者對(duì)多胺合成途徑限速酶鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的抑制作用，從而上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的多胺合成速度［3，4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除參與調(diào)控多胺代謝外，AZIN1還可以通過干擾中心體的復(fù)制以及直接與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用而影響細(xì)胞的分裂和增殖［5，6］，AZIN1表達(dá)異常也被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖異常性疾病，如腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)［7］。鑒于AZIN1在維持多種正常生理功能中的重要性和與疾病發(fā)生的密切相關(guān)性，本研究旨在建立人AZIN1蛋白原核表達(dá)純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并用原核表達(dá)的AZIN1蛋白為抗原制備抗AZIN1多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究AZIN1在調(diào)控細(xì)胞增殖及在疾病防治中的作用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a/AZIN1表達(dá)質(zhì)粒、大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）由作者實(shí)驗(yàn)室保存，限制性核酸內(nèi)切酶購自美國(guó) Fermentas 公司，兔抗His多克隆抗體為美國(guó)Proteintech公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL顯色液為美國(guó) Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Ni-NTA 樹脂為德國(guó) Novagen 公司產(chǎn)品；弗氏不完全佐劑和弗式完全佐劑為購自美國(guó) Sigma-aldrich 公司，其它化學(xué)試劑由美國(guó)Sigma等公司提供，DNA測(cè)序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a/AZIN1質(zhì)粒鑒定 pET-28a/AZIN1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在含有卡拉霉素的瓊脂平板內(nèi)篩選后，挑取單克隆菌落，接種到含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用限制性酶切及DNA測(cè)序鑒定。

1.2.2 人AZIN1蛋白原核表達(dá) 將測(cè)序正確的重組pET-28a/AZIN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，在含有卡拉霉素的瓊脂平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆接種到3 mL含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，待菌液OD值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）于37℃振蕩培養(yǎng)，分別在IPTG誘導(dǎo)0 h、2 h、4 h、6 h和8 h后取樣，700×g離心5 min，收集菌體并重懸于PBS 中（NaCl 137 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L），超聲裂解細(xì)菌后，11 000×g離心，分別取上清和沉淀制樣，經(jīng)SDS-PAGE分析AZIN1融合蛋白的表達(dá)情況，由此確定最佳外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.2.3 人AZIN1蛋白的純化及復(fù)性 將成功轉(zhuǎn)化pET-28a/AZIN1的BL21（DE3）陽性單克隆菌放大培養(yǎng)（1 000 mL培養(yǎng)液）。待菌液OD值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，700×g離心10 min收集菌體，經(jīng)高濃度尿素（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）裂解細(xì)菌，37℃振蕩裂解1 h，離心30 min去不溶性碎片。上清與Ni-NTA樹脂雜交2 h后上柱，用洗脫液A（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH6.3）洗脫雜蛋白，再用洗脫液B（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH4.3）洗脫目的蛋白。純化后的蛋白用遞減尿素濃度的PBS緩沖液（pH7.4）透析復(fù)性，每12 h換1次透析液，透析后的蛋白于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多克隆抗體制備 純化后的AZIN1蛋白用作抗原免疫Balb/c小鼠，首次免疫取100 g抗原與弗氏完全佐劑等體積乳化，背部皮下多點(diǎn)注射。兩周后做3次加強(qiáng)免疫，每次間隔時(shí)間兩周，加強(qiáng)免疫采用50 g AZIN1蛋白與弗氏不完全佐劑等體積乳化，背部皮下多點(diǎn)注射。末次免疫后1周摘小鼠眼球取血，37℃靜置1 h后，4℃，12 000 r/min離心收集血清，加入等體積甘油后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 制備的抗血清抗體效價(jià)檢測(cè) 間接ELISA法被用于檢測(cè)本研究制備的抗血清中AZIN1多克隆抗體效價(jià)。純化的人AZIN1蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為10 g/mL后，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃包被16 h，1%的BSA于37℃封閉2 h，然后加入系列稀釋的血清，100 μL/孔，以未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照，37℃孵育1 h；再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h；TMB法顯色，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A450值。以空白對(duì)照調(diào)零，待測(cè)孔A450值與陰性對(duì)照孔A450值的比值≥2. 1即判為陽性，以能獲得陽性的最大稀釋度作為待檢血清的抗體效價(jià)。

1.2.6 Western blot法鑒定制備的AZIN1抗體 以本實(shí)驗(yàn)制備的抗血清為一抗，Western blot法檢測(cè)人A549肺癌細(xì)胞、人Hela宮頸癌細(xì)胞以及小鼠B16-F1黑色素瘤細(xì)胞中AZIN1蛋白的表達(dá)。收集培養(yǎng)細(xì)胞，加全細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃12 000 r/min離心10 min后收集上清（細(xì)胞總蛋白）制樣，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后以200 mA恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，膜采用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h。用本實(shí)驗(yàn)制備的多克隆抗體為一抗（1∶3 000稀釋）4℃孵育過夜，羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h后TBST漂洗，ECL法顯色并記錄結(jié)果。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光法鑒定制備的AZIN1抗體B16-F1細(xì)胞置玻片培養(yǎng)，PBS洗滌3次，4%甲醛4℃固定細(xì)胞15 min，0.5%的TritonX-100室溫通透20 min，PBS洗滌玻片3次后，正常山羊血清室溫封閉30 min，每張玻片滴加本實(shí)驗(yàn)制備的抗血清（1∶200稀釋）后放入濕盒，4℃孵育過夜，PBS洗滌玻片后滴加熒光二抗（1∶200稀釋），濕盒中室溫避光孵育1 h，洗滌未結(jié)合的二抗后，滴加DAPI避光孵育10-15 min（復(fù)染細(xì)胞核），PBS洗去多余的DAPI，用含有抗熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡觀測(cè)結(jié)果。

1.2.8 細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定抗AZIN1抗體 實(shí)驗(yàn)步驟與前述細(xì)胞免疫熒光法類似，不同之處為，一抗孵育過夜后，每張玻片滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠IgG二抗（1∶200稀釋），37℃孵育30 min，PBS洗滌玻片3次，每次5 min。DAB顯色1-2 min后自來水清洗，吸干玻片上的水分后加蘇木精染色2 min，自來水沖洗，吸干玻片水分后樹脂封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒鑒定

pET-28a/AZIN1質(zhì)粒經(jīng)Xho I+Nde I酶切后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，可見1 350 bp和5 400 bp兩個(gè)限制性片段（圖1），結(jié)果與預(yù)期一致。酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序，證實(shí)質(zhì)粒中插入序列正確，閱讀框架對(duì)接無誤。

圖1 pET-28a/AZIN1質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 人AZIN1蛋白的原核表達(dá)和純化

將重組pET-28a/AZIN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）誘導(dǎo)0-6 h，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖2）顯示IPTG誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量50 kD附近有一新蛋白產(chǎn)生，與預(yù)期重組蛋白AZIN1的相對(duì)分子質(zhì)量一致，誘導(dǎo)4 h時(shí)重組蛋白的表達(dá)量最高。超聲裂解誘導(dǎo)后的細(xì)菌，上清、沉淀分別制樣，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3）顯示AZIN1蛋白主要存在于超聲后沉淀中，提示表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在。由于誘導(dǎo)表達(dá)的AZIN1蛋白帶有6× His標(biāo)簽，實(shí)驗(yàn)采用Ni-NTA親和層析法對(duì)表達(dá)菌中的AZIN1蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白經(jīng)透析復(fù)性后，用SDS-PAGE和Western blotting（抗His標(biāo)簽抗體作為一抗）對(duì)其進(jìn)行純度和特異性鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的AZIN1能被Ni-NTA高效純化。

2.3 抗AZIN1多克隆抗體鑒定

2.3.1 血清效價(jià)檢測(cè) 將純化的AZIN1蛋白用作抗原包被酶標(biāo)板，免疫血清等比稀釋后作為一抗，ELISA法檢測(cè)制備抗血清的效價(jià)，結(jié)果（圖5）顯示血清抗體效價(jià)可達(dá)到1∶640 000。

圖2 SDS-PAGE分析AZIN1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)的AZIN1蛋白在細(xì)菌內(nèi)的溶解性

圖4 SDS-PAGE分析人AZIN1蛋白的純化

圖5 ELISA分析制備抗血清的效價(jià)

2.3.2 制備抗體用于AZIN1的Western bloting檢測(cè)

以人宮頸癌HeLa細(xì)胞、小鼠黑素瘤B16-F1細(xì)胞、L929小鼠成纖維細(xì)胞裂解物及原核表達(dá)的人AZIN1蛋白為抗原，以制備的多克隆抗體為一抗，Western blotting檢測(cè)樣品中的AZIN1蛋白，結(jié)果（圖6）表明，制備的多克隆抗體能有效識(shí)別和結(jié)合人和小鼠的的AZIN1蛋白，可用于細(xì)胞內(nèi)源性和原核表達(dá)AZIN1蛋白的Western blot檢測(cè)。

圖6 制備抗體用于AZIN1的Western bloting檢測(cè)

2.3.3 制備抗體用于AZIN1的細(xì)胞免疫熒光分析 B16-F1黑色素瘤細(xì)胞置玻片培養(yǎng)后，以制備的多克隆抗體為一抗，以Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，免疫熒光法檢測(cè)B16-F1細(xì)胞內(nèi)AZIN1蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖7）顯示，制備抗體能有效用于AZIN1的細(xì)胞免疫熒光分析。

2.3.4 制備抗體用于AZIN1的細(xì)胞免疫化學(xué)分析 B16-F1黑色素瘤細(xì)胞置玻片培養(yǎng)后，以制備的多克隆抗體為一抗，陰性小鼠血清為對(duì)照，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)B16-F1細(xì)胞內(nèi)AZIN1蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖8）顯示，制備抗體能有效用于AZIN1的細(xì)胞免疫化學(xué)分析。

3 討論

天然多胺為所有活細(xì)胞的必需組分，參與多種重要的生理功能。研究表明，耗竭多胺將引起細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，而多胺水平異常升高則會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生［8，9］，因此維持細(xì)胞內(nèi)多胺自穩(wěn)對(duì)正常細(xì)胞生命活動(dòng)意義重大。AZIN1起初作為細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)多胺含量的蛋白質(zhì)因子而被廣泛關(guān)注［10］，隨后研究發(fā)現(xiàn)，AZIN1除了通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多胺水平而影響細(xì)胞增殖外，還可以通過干擾中心體的復(fù)制以及與細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1相互作用而調(diào)控細(xì)胞增殖［5，6］，由此AZIN1有望成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

圖7 制備抗體用于AZIN1的細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)（×400）

圖8 制備抗體用于AZIN1的細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)（×400）

為獲得大量可用作抗原免疫小鼠的AZIN1蛋白，我們將構(gòu)建的pET-28a/AZIN1原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21（DE3）中。分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌內(nèi)AZIN1重組蛋白能被IPTG誘導(dǎo)性表達(dá)，且主要以包涵體的形式存在，這可能與AZIN1重組蛋白誘導(dǎo)性表達(dá)的速度過快和細(xì)菌內(nèi)濃度過高有關(guān)。由于重組AZIN1蛋白的N端帶有6×His標(biāo)簽，我們?cè)谀蛩刈冃缘臈l件下利用Ni-NTA樹脂親和層析法成功獲得高純度的AZIN1蛋白。為制備抗AZIN1多克隆抗體，我們將純化后的AZIN1重組蛋白用做抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過1次啟動(dòng)免疫和3次加強(qiáng)免疫后，獲得高效價(jià)的抗AZIN1多克隆抗體。該多克隆抗體能特異性識(shí)別和結(jié)合人和小鼠真核細(xì)胞中表達(dá)的AZIN1蛋白，可有效用于AZIN1的免疫印跡、細(xì)胞免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了人AZIN1原核表達(dá)純化技術(shù)，成功制備了抗AZIN1多克隆抗體，上述研究結(jié)果有助于進(jìn)一步探索AZIN1在調(diào)控細(xì)胞增殖中的作用以及作為抗腫瘤藥物分子靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。

［1］Miller-Fleming L, Olin-Sandoval V, Campbell K, et al. Remaining mysteries of molecular biology：the role of polyamines in the cell［J］. J Mol Biol, 2015, 427（21）：3389-3406.

［2］Mastracci TL, Robertson MA, Mirmira RG, et al. Polyamine biosynthesis is critical for growth and differentiation of the pancreas［J］. Sci Rep, 2015, 5：13269.

［3］Keren-Paz A, Bercovich Z, Porat Z, et al. Overexpression of antizyme-inhibitor in NIH3T3 fibroblasts provides growth advantage through neutralization of antizyme functions［J］. Oncogene, 2006, 25（37）：5163-5172.

［4］Choi KS1, Suh YH, Kim WH, et al. Stable siRNA-mediated silencing of antizyme inhibitor：regulation of ornithine decarboxylase activity［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 328（1）：206-212.

［5］Murakami Y, Suzuki J, Samejima K, et al. The change of antizyme inhibitor expression and its possible role during mammalian cell cycle［J］. Exp Cell Res, 2009, 315：2301-2311.

［6］Mangold U, Hayakawa H, Coughlin M, et al. Antizyme, a mediator of biquitin-independent proteasomal degradation and its inhibitor localize to centrosomes and modulate centriole amplification［J］. Oncogene, 2008, 27（5）：604-613.

［7］Duensing S. Analysis of centrosomes in human cancer［J］. Methods Cell Biol, 2015, 129：51-60.

［8］Kusano T, Berberich T, Tateda C, et al. Polyamines：essential factors for growth and survival［J］. Planta, 2008, 228（3）：367-381.

［9］Casero RA, Marton LJ. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases［J］. Nature Reviews Drug Discovery, 2007, 6（5）：373-390.

［10］Olsen RP, Zetter BR. Evidence of a role for antizyme and antizyme imhibitor as regulators of human cancer［J］. Mol Cancer Res, 2011, 9（10）：1285-1293.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Prokaryotic Expression，Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Human Antizyme Inhibition Factor-1

Lü Ya-feng YANG Jian-lin QIN Yu WANG Yan-lin
（Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy，Three Gorges University Medical College，Yichang 443002）

We aim to carry out prokaryotic expression and purification of human antizyme inhibition factor-1（AZIN1），and to prepare as well as identify polyclonal antibody against AZIN1. Prokaryotic expression vector pET-28a/AZIN1 was transformed into Escherichia coli BL21（DE3），in which the recombinant AZIN1 was expressed by IPTG induction and purified by affinity chromatography with Ni-NTA resin under denaturing condition. The purified recombinant AZIN1 was used as the antigen to prepare the antibody in the BALB/c mice. The titer and specificity of anti-sera were detected by ELISA，Western blot，cell immunofluorescence，and immunochemistry. As results，restriction analysis and DNA sequencing proved that the plasmid pET-28a/AZIN1 was constructed successfully. In E. coli，recombinant AZIN1 protein was expressed by IPTG induction and mainly existed in a form of inclusion body. The AZIN1 protein expressed in the E. coli was effectively purified using affinity chromatography. When used as the antigen to immune mice，this protein induced the production of specific antibody against AZIN1 with serum titer of 1∶640 000. The prepared antiserum specifically recognized and bound to the AZIN1 protein expressed in human or mouse tumor cells. And this antiserum was efficiently used in the analysis for AZIN1 by Western blot，cell immunofluorescence，and cell immunochemistry. In conclusion，the prokaryotic expression and purification of human AZIN1 protein and preparation of polyclonal antibody against AZIN1 were successfully performed in this study. These results provide a basis for further research on the roles of AZIN1 in regulating cell proliferation and in disease prevention and treatment.

antizyme inhibition factor-1；prokaryotic expression；antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.028

2016-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81372265）

呂亞豐，男，碩士研究生，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)；E-mail：yafenglv@yahoo.com

王艷林，男，博士，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)；E-mail：fzswangyl@ctgu.edu.cn