H2S通過上調(diào)HO-1表達(dá)保護(hù)壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠腸黏膜

曾照軍鐘 森王家寧唐俊明張 蕾王金堂趙 旸

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院1.兒科，2.臨床醫(yī)學(xué)研究所（湖北十堰 442000）

H2S通過上調(diào)HO-1表達(dá)保護(hù)壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠腸黏膜

曾照軍1鐘 森1王家寧2唐俊明2張 蕾2王金堂1趙 旸1

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院1.兒科，2.臨床醫(yī)學(xué)研究所（湖北十堰 442000）

目的觀察新型外源性硫化氫（H2S）供體GYY4137對壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）大鼠腸黏膜的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法取60只健康新生SD大鼠，隨機(jī)分成4組。正常對照組，不施加任何干預(yù)；NEC模型組，通過人工喂養(yǎng)、缺氧、冷刺激、脂多糖方法制備NEC模型；H2S干預(yù)組，在NEC模型的基礎(chǔ)上，腹腔注射H2S供體GYY4137；血紅素加氧酶-1（HO-1）抑制劑組，在H2S干預(yù)組已有干預(yù)的基礎(chǔ)上，腹腔注射HO-1抑制劑Znpp。于試驗第4天處死大鼠，取回盲部腸管進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色并作組織病理學(xué)評分；檢測各組新生鼠小腸組織中丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）含量，腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平以及腸道組織HO-1表達(dá)。結(jié)果4組新生大鼠腸組織病理評分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），NEC模型組的病理評分最高，其次為HO-1抑制劑組、H2S干預(yù)組。NEC組病理評分≥2，表明建模方法有效。NEC組與對照組相比，MDA及TNF-α含量明顯上升，T-SOD含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H2S干預(yù)組同NEC組相比，MDA及TNF-α含量明顯降低，T-SOD含量明顯升高，HO-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HO-1抑制劑組較H2S干預(yù)組相比，MDA及TNF-α含量明顯升高，T-SOD含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論新型H2S供體GYY4137能夠有效保護(hù)NEC大鼠腸黏膜，降低MDA及TNF-α的含量，增加T-SOD的含量；其保護(hù)作用可能與上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

壞死性小腸結(jié)腸炎； 硫化氫； 血紅素加氧酶-1； 大鼠

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒期嚴(yán)重危及生命的疾病，后期容易引起膿毒癥及多器官功能障礙綜合征，治療效果差，預(yù)后不理想，死亡率高[1]。雖然目前關(guān)于NEC的確切發(fā)病機(jī)制尚無定論，但學(xué)者認(rèn)為過度的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)在NEC發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用[2]。

H2S作為人類發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化、血管調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)等作用[3]。在胃腸疾病中，H2S在炎癥性腸?。↖BD）、非甾體類抗炎藥（NSAIDs）所致的胃黏膜損傷、結(jié)腸腫瘤中發(fā)揮作用[4]。本研究探討H2S對NEC大鼠腸黏膜的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與分組

1.2 方法

1.2.1 NEC建模與喂養(yǎng) 采用張丙宏等[5]在三因素聯(lián)合造模[6]的基礎(chǔ)上，改進(jìn)方法制備NEC模型，即將新生12 h內(nèi)的SD大鼠置入保育箱中喂養(yǎng)（37℃，濕度45%～55%)，采用鼠乳代用品人工喂養(yǎng)，并定期給予脂多糖（LPS 2.5 mg/kg，美國Sigma公司）腹腔注射，缺氧冷刺激，以建立新生SD大鼠NEC模型；H2S干預(yù)組同時腹腔注射H2S供體GYY4137 10 mg/(kg·d)，2次/d，共3天；HO-1抑制劑組在H2S干預(yù)組的基礎(chǔ)上腹腔注射Znpp 10 mg/(kg·d)，2次/d，共3 d。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有新生大鼠在第4天空腹12 h后斷頭法處死，取回盲部腸管組織3 cm，其中1 cm左右固定于10%多聚甲醛溶液中，用于病理組織學(xué)分析，另外2 cm儲存在液氮中，用于生化分析及蛋白質(zhì)印記技術(shù)。

1.2.3 組織病理學(xué)分析 將固定于10%多聚甲醛中的小腸組織經(jīng)脫水、石蠟包埋后切取冠狀面腸管組織，水化后蘇木精-伊紅（HE）染色，每組隨機(jī)選取6張切片，由2名觀察者按照Nadler標(biāo)準(zhǔn)獨立評分[7]。0分：腸道絨毛及上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分：輕微黏膜下或固有層腫脹分離；2分：中度黏膜下和/或固有層分離，黏膜下和/或肌層水腫；3分：重度黏膜下和/或固有層分離，甚至局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失伴腸壞死。如遇意見不一致，交由第三位研究人員討論確定病理評分。其中病理評分≥2分視為NEC建模成功。

1.2.4 HO-1表達(dá)檢測 采用Western blot方法。從液氮中取出大鼠腸管組織，去濕稱重后按照100 mg組織比500 μL緩沖液的比例加入蛋白裂解緩沖液，提取待測組織總蛋白，10%聚丙烯酰氨凝膠電泳后將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入HO-1及GAPDH一抗，4℃冰箱孵育過夜，相應(yīng)二抗孵育2 h，最后將含有目的蛋白的硝酸纖維膜置于ChemiDoc XPS發(fā)光系統(tǒng)顯影。

1.2.5 小腸超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量檢測 取回盲部腸管組織去濕稱重后，用冰生理鹽水作為勻漿遞質(zhì)制作10%勻漿液。采用南京建成生物工程研究所提供的SOD及MDA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書檢測各組SOD及MDA含量。

1.2.6 炎癥因子TNF-α的檢測 按照深圳欣博盛生物科技有限公司提供的TNF-α ELISA試劑盒說明書提供的操作方法，以冰生理鹽水作為勻漿遞質(zhì)制備小腸組織勻漿液，用雙抗體夾心法檢測各組TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

基于動態(tài)加密因子的對稱加解密通信算法，采用動態(tài)加密因子作為算法因子。動態(tài)加密因子由兩部分組成，一個是登錄的用戶名(注：包含用戶名但不限用戶名，這里泛指所有可變的動態(tài)字符串，例如：時間戳、GUID(全局唯一標(biāo)識符)、隨機(jī)數(shù)等等，本文統(tǒng)一采用“登錄用戶名”描述)，一個是可配置的混淆因子。

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)范圍表示，組間比較采用Kruskal Wallis H秩和檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對照組大鼠進(jìn)食、排便正常，未出現(xiàn)胃腸道及其他不良反應(yīng)。NEC模型組大鼠從建模第一天開始出現(xiàn)活動量明顯減少，精神萎靡，大便變稀甚至變黑，之后陸續(xù)開始出現(xiàn)進(jìn)奶量減少，喂養(yǎng)困難，排膿血樣變，進(jìn)而消瘦，皮膚色澤變暗甚至出現(xiàn)明顯發(fā)紺、嗜睡。H2S干預(yù)組也出現(xiàn)輕微大便變稀，對刺激反應(yīng)變差，但喂奶相對容易，食欲較好，體質(zhì)量略有增加。HO-1抑制劑組大鼠表現(xiàn)基本同NEC模型組，出現(xiàn)不同程度排膿血樣便、發(fā)紺、抽搐、嗜睡。

2.2 腸組織損傷情況及病理評分

正常對照組大鼠回盲部腸管呈乳黃色，富有彈性及光澤，病理評分多為0分。NEC組腸管明顯擴(kuò)張充氣，彈性差，腸壁菲薄呈黑紅色，部分穿孔，腹腔不同程度積液，有腥臭味，病理評分多為3分以上。H2S干預(yù)組腸管擴(kuò)張充氣程度較NEC組減輕，腸管暗紅色，彈性及光澤度較差，腹腔積液有所改善，病理評分多為2分左右。HO-1抑制劑組腸管擴(kuò)張充氣程度較H2S干預(yù)組明顯加重，腸管暗紅色，腸壁菲薄甚至穿孔，腹腔大量積液，病理評分明顯增加。4組新生大鼠腸組織病理評分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=19.35，P＜0.001），NEC模型組的病理評分最高，其次為HO-1抑制劑組、H2S干預(yù)組。各組新生大鼠腸管HE染色見圖1，光鏡下表現(xiàn)及病理評分見表1。NEC模型組的病理評分結(jié)果及該組大鼠出現(xiàn)的相關(guān)癥狀表明NEC模型，該實驗有效。

圖1 大鼠小腸組織病理（HE×400）

2.3 腸組織HO-1蛋白表達(dá)的變化

正常對照組HO-1表達(dá)量很低，NEC組HO-1的表達(dá)水平有所提高，H2S干預(yù)組HO-1的表達(dá)量較NEC顯著提高，HO-1抑制劑Znpp可以明顯抑制HO-1的生成。見圖2。

圖2 各組大鼠小腸組織HO-1表達(dá)情況

2.4 腸組織T-SOD及MDA含量變化

4組新生大鼠腸管組織T-SOD及MDA含量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001），NEC組較正常對照組相比，腸組織T-SOD活力明顯降低，MDA含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；用H2S供體GYY4137干預(yù)后，與NEC組相比腸組織T-SOD活力有所恢復(fù)，MDA含量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在腹腔注射HO-1的抑制劑Znpp后，與H2S干預(yù)組相比，SOD活力明顯降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與NEC組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 各組HE染色光鏡下表現(xiàn)及病理評分 [M(P25～P75)]

表2 各組小腸組織內(nèi)T-SOD、MDA、TNF-α水平 (±s)

表2 各組小腸組織內(nèi)T-SOD、MDA、TNF-α水平 (±s)

注：1)與正常對照組相比，P＜0.05；2)與NEC模型組相比，P＜0.05；3)與H2S干預(yù)組相比，P＜0.05

組 別 只數(shù) T-SOD/U·mg－1 MDA/nmol·mg－1 TNF-α/pg·mL－1正常對照組 6 84.26±3.01 2.58±0.25 15.51±1.58 NEC模型組 6 60.21±2.391) 8.51±0.871) 134.83±7.781)H2S干預(yù)組 6 74.45±2.501)2) 4.55±0.571)2) 84.00±3.161)2)HO-1抑制劑組 6 62.23±2.261)3) 7.33±0.751)3) 136.33±5.391)3)F值 115.40 108.49 760.78 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.5 腸組織TNF-α含量變化

4組新生大鼠腸管組織炎癥因子TNF-α含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），NEC組TNF-α含量較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腹腔注射GYY4137后，與NEC組相比TNF-α含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而在腹腔注射HO-1抑制劑Znpp后，與H2S干預(yù)組相比，TNF-α的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與NEC組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

NEC是在多種因素作用下發(fā)病，目前認(rèn)為與早產(chǎn)兒胃腸道功能不成熟、喂養(yǎng)方法不當(dāng)、早產(chǎn)、新生兒期窒息、低氧、感染等因素相關(guān)[8]。其好發(fā)部位為回盲部腸管，主要病理改變?yōu)槟c管擴(kuò)張充氣，黏膜壞死，腸壁變薄甚至穿孔，嚴(yán)重者腸壁全層壞死。該病好發(fā)于早產(chǎn)兒，特別是極低出生體質(zhì)量兒，早期缺乏典型的臨床癥狀及體征，診斷困難，同時缺乏有效的治療方法，國內(nèi)報道其病死率高達(dá)10%～50%。[9]

H2S是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后人類發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，在機(jī)體生理及病理情況下都發(fā)揮著重要的作用[10]。有研究表明H2S可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡作用保護(hù)缺血再灌注導(dǎo)致的胃黏膜細(xì)胞損害[11]。本實驗雖然采用了不同的疾病模型，但得出了相同的結(jié)果：H2S干預(yù)后，NEC大鼠腸黏膜損傷明顯減輕，腸絨毛部分恢復(fù)正常形態(tài)，腸管擴(kuò)張充氣有所改善，腹腔積液減少。這表明，H2S可以減輕NEC大鼠的腸黏膜損傷。

SOD是體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶，能夠抑制脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[12]。NEC發(fā)生后，大鼠小腸SOD活性明顯降低，對氧自由基清除能力下降，并導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和機(jī)體炎癥反應(yīng)。MDA是氧自由基引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程的產(chǎn)物，NEC發(fā)生后，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化加劇，MDA產(chǎn)生明顯增加，細(xì)胞膜通透性增加，胞內(nèi)Ca2+濃度過大導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時使膜蛋白變性，引起炎性滲出。由此可見對SOD及MDA含量的檢測可直接或間接反映機(jī)體氧自由基的過程，評價組織受損程度。

HO-1又被稱為熱休克蛋白，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，HO-1可作為保護(hù)性蛋白被誘導(dǎo)。生理情況下，腸道中HO-1基本不表達(dá)，但在缺血、缺氧、再灌注損傷的情況下，HO-1的表達(dá)增加[13]。在本研究中，NEC發(fā)生后，由于腸組織缺血缺氧及感染，HO-1的表達(dá)較正常對照組明顯增加。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，H2S在心肌炎及慢性心力衰竭中發(fā)揮保護(hù)作用時，HO-1的表達(dá)上調(diào)[14,15]，另有研究發(fā)現(xiàn)在人類腎臟損傷細(xì)胞里，H2S可以誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)[16]。而HO-1基因缺陷新生小鼠較HO-1基因正常小鼠腸壞死明顯加重，炎癥反應(yīng)更為劇烈[17]。這些研究表明，H2S可能通過刺激HO-1的生成來發(fā)揮上述作用。本實驗的結(jié)果也證實了這一點，在加入HO-1的抑制劑Znpp后，H2S對NEC腸黏膜的保護(hù)作用消失，病理評分增加，SOD含量降低，MDA及TNF-α含量增加。

由此我們推測，H2S新型供體GYY4137對NEC大鼠腸黏膜的保護(hù)作用可能是由于誘導(dǎo)了HO-1這一關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，由HO-1發(fā)揮抗氧化、抗炎作用。HO-1可將血紅蛋白分解代謝成為膽綠素、膽紅素、鐵離子以及一氧化碳，這些分子通過不同的途徑減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，最終保護(hù)了NEC大鼠的小腸黏膜。本實驗對H2S保護(hù)NEC大鼠腸黏膜進(jìn)行了初步研究，推測H2S可能是HO-1的誘導(dǎo)劑，但是對GYY4137如何刺激HO-1產(chǎn)生這一關(guān)鍵機(jī)制未能闡明，因此還需設(shè)計相關(guān)研究論證這一點。H2S有多種類型供體，性質(zhì)各異，是否其他類型供體也具有同等的保護(hù)作用也需要驗證。本研究為NEC的治療開闊了新思路，H2S有可能成為NEC治療的潛在藥物。

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Hydrogen sul fi de protects intestinal mucosa in a neonatal rat model of necrotizing enterocolitis by upregulating the expression of HO-1

ZENG Zhaojun1, ZHONG Sen1, WANG Jianing2, TANG Junming2, ZHANG Lei2, WANG Jintang1, ZHAO Yang1(1.Department of Pediatrics , 2.Clinical Research Institute，Renmin Hospital of Shiyan，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei, China)

ObjectiveTo explore the protective effects of GYY4137, a new hydrogen sulfide donor, on intestinal mucosa in a neonatal rat model of necrotizing enterocolitis (NEC), and its potential mechanism.MethodsSixty SD rats were randomly assigned into 4 groups:group A (control group), group B (NEC group), group C (NEC with GYY4137 treatment, H2S donor group), and group D (NEC with GYY4137 and Znpptreatment, HO-1 inhibitor group).The SD rat models of NEC were established using simulated milk feeding-hypoxia-cold stress-Lipopolysaccharides.The injury degree of intestinal mucosa was evaluated using HE-staining, and its mechanisms were investigated using biochemical indicators and Western blotting.ResultsCompared with control group, the pathology score and the total superoxide dismutase (T-SOD) in the NEC group was significantly higher, the concentrations of methane dicarboxylic aldehyde (MDA) and necrosis factor α (TNF-α) were lower（P＜0.05）.Compared with those in NEC group, the pathology score and the concentration of MDA and TNF-α in the H2S donor group were signi fi cantly lower, the T-SOD, and the HO-1 expression was higher.The pathology score and the level of MDA and TNF-α were signi fi cantly increased after treated with HO-1 inhibitor Znpp, and T-SOD was signi fi cantly decreased..ConclusionsThe GYY4137, as a new H2S donor, could attenuate the injury of intestinal mucosa in a neonatal rat model of NEC by upregulating the expression of HO-1.

necrotizing enterocolitis; hydrogen sul fi de; hemeoxygenase-1; rat

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.015

2016-08-17)

(本文編輯：鄒 強(qiáng))

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