豬傳染性胃腸炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

李子祥,邵春艷,2*,徐 琦,孫 靜,2,姜 勝,2,何海建,吳 媛,王曉杜,2,宋厚輝,2**

(1.浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300； 2.浙江農林大學 動物健康檢測中心，浙江 臨安 311300；3.金華職業(yè)技術學院 農業(yè)與生物工程學院，浙江 金華 321007)

豬傳染性胃腸炎病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

李子祥1,邵春艷1,2*,徐 琦1,孫 靜1,2,姜 勝1,2,何海建3,吳 媛3,王曉杜1,2,宋厚輝1,2**

(1.浙江農林大學 動物科技學院，浙江 臨安 311300； 2.浙江農林大學 動物健康檢測中心，浙江 臨安 311300；3.金華職業(yè)技術學院 農業(yè)與生物工程學院，浙江 金華 321007)

針對豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S基因的保守序列設計引物，以TEGV疫苗毒株為模板，克隆S基因，并構建重組陽性質粒，優(yōu)化反應體系和擴增條件，建立基于SYBR Green Ⅰ染料的實時熒光定量PCR檢測方法，并對其特異性、重復性和靈敏度進行分析。結果顯示：建立的檢測方法靈敏度可達10拷貝/μL，標準曲線線性關系良好 (r=0.997)，擴增效率高，具有良好的特異性和重復性。使用該方法對124份臨床疑似TGEV病料進行檢測，陽性樣本有17份，檢測樣本的陽性率為13.7%。該方法可用于獸醫(yī)臨床上TGEV的快速檢測和流行病學分析。

豬傳染性胃腸炎； 實時熒光定量PCR； 特異性； 敏感性

豬傳染性胃腸炎(TGE)是由冠狀病毒科的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種高度接觸性胃腸傳染病，主要侵害仔豬，病豬表現(xiàn)為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水及迅速消瘦等癥狀，其中,2周齡以內仔豬患病后死亡率可達100%。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類疫病中必須檢疫的豬傳染病[1]。我國最早于1956年在廣東報道該病，目前,TGE在全國各地均有發(fā)生，個別養(yǎng)殖場TGE發(fā)病率甚至高達72.5%[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高，該病的發(fā)生呈明顯加重的趨勢，且常與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬輪狀病毒(RV)等混合感染[3-4]，使得病情更加嚴重，而單純依靠臨床癥狀很難對該病進行鑒別診斷。因此，急需建立一種快速、靈敏和特異的檢測方法，為TGEV的實驗室診斷提供依據(jù)。

目前，針對TGEV的核酸檢測方法，農業(yè)部于2015年出臺了TGEV診斷技術標準(SN/T 548—2015)，遼寧、江蘇和廣西等省也出臺一些地方檢測標準，但這些標準采用的檢測方法均是普通PCR方法，操作繁瑣、耗時長、靈敏度低，不能滿足目前臨床檢測的需求。實時熒光定量PCR是目前應用廣泛的病原檢測技術，該方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、可準確定量、不易產生交叉污染和檢測過程短等優(yōu)點。為此，針對TGEV的S基因序列上的保守區(qū)域設計熒光定量PCR引物，采用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測方法，優(yōu)化反應體系和擴增條件，建立針對TGEV的實時熒光定量PCR檢測方法，以實現(xiàn)樣品從核酸到結果判定的一步法檢測，旨在為TGEV的臨床診斷、疫病監(jiān)控和流行病學調查等方面提供新的快速檢測技術。

1 材料和方法

1.1 毒株

TGEV疫苗(華毒株)、PEDV疫苗(CV777株)、RV疫苗(NX株)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)疫苗(C株)、豬偽狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)疫苗(Bartha-K61株)、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗(LG株)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 病料采集與保存

于浙江省各大規(guī)?；i場采集嘔吐、腹瀉癥狀的仔豬糞便或病死豬的小腸內容物，共計124份，置于-80 ℃冷凍保存。

1.3 試劑

QIAamp Viral RNA Mini 和DNA提取試劑盒購于凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司，腸道病毒核酸提取試劑盒購于蘇州天隆生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker、pMD-18 T Simple載體、Reverse Transcriptase M-MLV、Taq酶、SYBR Premix ExTaq、One step SYBR primeScript RT-PCR 試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司，質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、無水乙醇、氯化鈉等化學藥品均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 主要儀器

生物樣品均質器(Bertin Precellys 24)購自法國Bertin Technologies公司，熒光定量PCR儀(Agilent MX3000P)購自安捷倫科技(中國)有限公司，高速冷凍離心機(Eppendorf 5415R)和梯度PCR儀器(Eppendorf Mastercycler pro)購自Eppendorf公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)(UVP EC3)購自上海玉博生物科技有限公司，全自動核酸提取儀(NP968)購自蘇州天隆生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank公布的TGEVS基因序列，用Primer Express 3.0軟件進行生物信息學分析并設計引物，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，上游引物TGEV-F序列：5′-CTCACCACCTACTACCACCACAGA-3′，下游引物TGEV-R序列：5′-CTAGCACCATGTAAATAAGCAACAACCTC-3′，預期擴增片段長度為175 bp。

1.5.2 疫苗株病毒和臨床腹瀉樣品的核酸提取及RNA反轉錄 參照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書，提取TGEV、PEDV、RV和CSFV各疫苗株的總RNA，參照DNA提取試劑盒說明書提取PCV-2和PRV疫苗的DNA，臨床組織病料參照腸道病毒核酸提取試劑盒說明書，用全自動核酸提取儀提取其核酸樣品，分別取2 μL進行濃度/純度測定，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照Reverse Transcriptase M-MLV的說明，分別將各疫苗株提取的TGEV、PEDV、RV、CSFV和PRV 總RNA反轉錄為cDNA，反應程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，4 ℃保存，反轉錄后的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.5.3.1 標準陽性質粒的制備 按1.5.2方法，以合成的TGEV cDNA為模板(DEPC H2O為陰性對照)，以1.5.1合成的引物進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并連接到pMD-18 T Simple載體上。連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，提取質粒并對重組質粒進行PCR和測序驗證。對測序驗證正確的重組質粒用微量分光儀測定質粒濃度，根據(jù)公式計算質?？截悢?shù)，并進行10倍梯度稀釋，含量分別為1×108～1拷貝/μL，作為實時熒光定量PCR方法的陽性標準品，用于標準曲線的繪制和靈敏度的測定。

1.5.3.2 實時熒光定量PCR擴增 參考SYBR Premix ExTaq推薦的反應體系，以1×104拷貝/μL陽性質粒作為模板，模板含量和PCR體系總體積不變，采用矩陣法優(yōu)化上下游引物濃度，采用梯度PCR優(yōu)化退火溫度，獲得最佳反應體系和反應程序。

1.5.3.3 實時熒光定量PCR標準曲線的建立 以1×108～10拷貝/μL的陽性質粒為模板，以1.5.3.2優(yōu)化好的反應體系和反應程序進行熒光定量PCR擴增，得到擴增曲線和溶解曲線，Agilent MX3000P軟件自動繪制標準曲線，計算出標準曲線方程、相關系數(shù)(r)及擴增效率(E)。

1.5.3.4 敏感性試驗 以1×108～1 拷貝/μL的陽性質粒為模板，以1.5.3.2優(yōu)化好的反應體系和反應程序進行熒光定量PCR擴增，以檢出的最低稀釋度對應的病毒拷貝數(shù)作為該檢測方法的靈敏度。

1.5.3.5 特異性試驗 將TGEV、PEDV、RV、CSFV、PRV、PCV-2疫苗株的cDNA或DNA，按照上述優(yōu)化的條件進行熒光定量PCR，驗證其特異性。

1.5.3.6 重復性試驗 分別取1×102～1×104拷貝/μL的TGEV陽性標準品按上述實時熒光定量PCR法進行 3次重復測定，同一濃度設3個重復孔，以驗證實時熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性和重復性。

1.5.4 臨床樣品的測定 利用建立的實時熒光定量PCR方法對124份臨床腹瀉樣品進行TGEV病原檢測，反應體系如下：2× One Step SYBR RT-PCR Buffer 10 μL、Enzyme Mix 0.8 μL、上游引物TGEV-F 0.4 μL(10 μmol/L)、下游引物TGEV-R 0.4 μL(10 μmol/L)、ROX 50× 0.4 μL、RNA 2 μL，加DEPC H2O至20 μL。反應程序為：反轉錄42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；PCR擴增95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 60 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。同時分別設TGEV陽性質粒和DEPC H2O為陽性和陰性對照。

2 結果與分析

2.1 標準陽性質粒的構建

以TGEV疫苗株cDNA為模板進行PCR擴增，獲得大小約175 bp的擴增產物，與預期結果一致(圖1)。將目的片段切膠回收并連接到pMD-18 T Simple載體上，提取陽性質粒并測序。經序列比對，陽性質粒的測序結果與TGEV相應區(qū)域序列100%相同，命名該質粒為pSL371。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2、3.TGEV疫苗株

2.2 實時熒光定量PCR反應體系及反應程序的建立

分別對退火溫度、引物濃度和擴增循環(huán)數(shù)等條件進行優(yōu)化，結果表明，在退火溫度為60 ℃、引物濃度為0.2 μmol/L、擴增循環(huán)數(shù)為40次時，熒光定量PCR擴增結果最佳。確定最終反應體系如下：2×SYBR PremixTaq10 μL、上游引物TGEV-F0.4 μL(10 μmol/L)、下游引物TGEV-R 0.4 μL(10 μmol/L)、ROX 50× 0.4 μL、cDNA 1 μL，加DEPC H2O至20 μL。反應程序為：預變性95 ℃ 30 s；擴增95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 60 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。

2.3 實時熒光定量PCR標準曲線

以10倍梯度稀釋的重組質粒為模板，采用優(yōu)化的TGEV實時熒光定量PCR反應條件進行擴增，Agilent MX3000P軟件繪制標準曲線如圖2所示，當TGEV陽性質粒含量為1×108～10 拷貝/μL時，標準曲線方程為Y=-2.767×logX+ 40.61，相關系數(shù)(r)=0.997，擴增效率(E)=129.8%，說明線性關系良好，可信度高。

圖2 TGEV標準陽性質粒實時熒光定量PCR標準曲線

2.4 實時熒光定量PCR敏感性

以10倍梯度稀釋的1×108～1 拷貝/μL重組質粒為模板，采用優(yōu)化的熒光定量PCR反應條件進行擴增。結果顯示，108～10 拷貝/μL病毒cDNA均有典型S型擴增曲線(圖3)，而1 拷貝/μL未出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，溶解曲線峰狹窄單一，沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現(xiàn)，解鏈溫度為81.3 ℃(圖4)，所以該方法對質粒cDNA檢測靈敏度為10拷貝/μL。

1—9分別表示模板為1×108～1 拷貝/μL

圖4 TGEV實時熒光定量PCR敏感性溶解曲線

2.5 實時熒光定量PCR特異性

以TGEV、PEDV、RV、CSFV、PRV和PCV-2各疫苗株的總cDNA或DNA為模板進行熒光定量PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn),僅TGEV出現(xiàn)特異性S型擴增曲線，其他病毒均未出現(xiàn)S型擴增曲線(圖5)，溶解曲線也只有TGEV有單峰出現(xiàn)，解鏈溫度為81.5 ℃(圖6)，表明所建立的方法具有較強的特異性。

2.6 實時熒光定量PCR重復性試驗結果

利用本研究建立的熒光定量PCR方法，分別取1×102、1×103、1×104拷貝/μL的TGEV陽性樣品按上述熒光定量PCR法進行 3次重復測定(組間)，同一含量設3個重復孔(組內)，分別計算各含量組內和組間Ct值的變異系數(shù)。結果表明，各陽性樣品組內與組間變異系數(shù)均小于5%(表1)，表明該方法的重復性良好。

圖5 TGEV實時熒光定量PCR特異性試驗的擴增曲線

圖6 TGEV實時熒光定量PCR特異性試驗的溶解曲線

TGEV質粒含量/(拷貝/μL)組內變異系數(shù)/%組間變異系數(shù)/%1×1022．162．251×1031．082．651×1041．152．88

2.7 TGEV實時熒光定量PCR對臨床樣品的測定結果

利用上述建立的熒光定量PCR方法對臨床采集的124份病豬組織樣品進行TGEV的檢測，結果顯示(表2)，樣本中TGEV陽性率為13.7%(95%CI=8.2%～21.0%)。

表2 熒光定量PCR檢測124份豬病料結果

3 結論與討論

TGE在我國流行廣泛，主要引起2周齡以內仔豬的嘔吐和嚴重腹瀉，死亡率可高達100%，該病的發(fā)生和流行具有明顯的季節(jié)性，傳播速度快，對生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失[5]。臨床上TGEV與PEDV、RV和德爾塔冠狀病毒(PDCoV)等[6]混合感染的情況非常普遍，給疾病的鑒別診斷帶來很大的困難。所以，建立一種快速、靈敏度高和特異性好的檢測方法顯得尤為重要。目前,TGEV常規(guī)檢測鑒定方法有病毒分離鑒定、電鏡觀察、免疫電鏡觀察、ELISA、中和試驗和核酸探針雜交等[7-9]，郭容利等[10]、朱芬花[11]和張坤等[12]分別建立了TGEV的RT-PCR或者多重RT-PCR方法，但這些方法操作復雜、周期較長，不能很好地為臨床檢測提供服務。目前,動物疫病特別是病毒性疾病的實驗室檢測，最常用的定量PCR方法就是基于SYBR Green Ⅰ的熒光染料法和基于Taq Man的探針法，其中SYBR Green Ⅰ為一種結合于DNA小溝中的熒光染料，擴增之后，可以通過擴增曲線判斷病原含量，根據(jù)溶解曲線識別擴增產物。

本研究建立的TGEV基于SYBR Green Ⅰ染料法實時熒光定量PCR檢測方法，操作簡單，使用商品化的一步法SYBR Green Ⅰ熒光定量檢測試劑盒，就可以完成以樣品RNA為模板的反轉錄和PCR擴增。與普通PCR相比，該方法采用高靈敏度的光電系統(tǒng)對SYBR Green Ⅰ熒光信號進行檢測，實現(xiàn)在同一管內同時進行擴增和檢測，不需要再開蓋進行電泳檢測，避免了樣品交叉污染和溴化乙錠(EB)的使用。采用本檢測方法在2～3 h內即可完成大批量樣品的定量檢測，有效提高了工作效率，減少了勞動量。本檢測方法與PEDV、RV、PRV、CSFV、PCV2不發(fā)生交叉反應，對陽性質粒檢測極限為10拷貝/μL，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、操作簡單、快速高效等優(yōu)點，可用于TGEV感染的早期診斷或鑒別診斷，為TGEV流行病學監(jiān)測提供技術支持。

[1] Zhao S,Gao J,Zhu L,etal.Transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhoea virus infection induces dramatic changes in the tight junctions and microfilaments of polarized IPEC-J2 cells[J].Virus Res,2014,192(4):34-45.

[2] 蔣靜,李健,胡永強,等.上海等4省市動物冠狀病毒的流行病學調查[J].畜牧與獸醫(yī)，2007,39(12): 50-52.

[3] Lin CM,Gao X,Oka T,etal.Antigenic relationships among porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus strains[J].J Virol,2015,89(6): 3332-3342.

[4] 呂興華.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的鑒別[J].山東畜牧獸醫(yī),2016,20(1):71.

[5] 李同雪.規(guī)?；i場主要病毒性腹瀉流行現(xiàn)狀及防控對策[J].河南畜牧獸醫(yī)(綜合版),2016,37(4): 26-28.

[6] 陳建飛,王瀟博,焦賀勛,等.國內首株豬德爾塔冠狀病毒Porcine deltacoronavirus的分離鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(3):171-174.

[7] 張蕾,董毅.豬傳染性胃腸炎病毒感染機理的研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2009(7):79-82.

[8] 周燕,王建超,華平,等.豬傳染性胃腸炎病毒在ST 細胞中增殖規(guī)律的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(6):423-427.

[9] 謝立蘭,方六榮,方華為,等.免疫學和分子生物學技術在豬傳染性胃腸炎診斷中的應用進展[J].中國獸藥雜志,2016,50(2):56-62.

[10] 郭容利,何孔旺,倪艷秀,等.PEDV、TGEV、PRV多重 RT-PCR檢測方法的建立及其應用[J].江蘇農業(yè)學報,2013,29(5):1065-1069.

[11] 朱芬花.應用RT-PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(4):91-93.

[12] 張坤,何啟蓋.豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].畜牧獸醫(yī)學報,2010,41(8):1001-1005.

Development and Application of Real Time Fluorescence Quantitative PCR for Transmissible Gastroenteritis Virus Detection

LI Zixiang1,SHAO Chunyan1,2*,XU Qi1,SUN Jing1,2,JIANG Sheng1,2,HE Haijian3, WU Yuan3,WANG Xiaodu1,2,SONG Houhui1,2**

(1.College of Animal Science and Technology,Zhejiang A & F University,Lin’an 311300,China；2.Animal Health Inspection Center,Zhejiang A & F University,Lin’an 311300,China；3.School of Agriculture and Biological Engineering,Jinhua Polytechnic,Jinhua 321007,China)

In this study,a real-time PCR method was developed for TGEV detection using SYBR Green I dye.The primers were designed according to the conserved region of TGEVSgene.The specific sequence was cloned using the attenuated TGEV strain as a template.The positive recombinant plasmid was constructed.The amplification system and conditions of real time PCR was optimized.Then the sensitivity,specificity and repeatability of this assay were analyzed.The results showed that the sensitivity of this assay was 10 copies/μL of cDNA plasmid,the correlation co-efficient of the standard curve was 0.997.A total of 124 clinical samples were tested by this method,with 17 positive results.The positive rate of TGEV was 13.7%.In conclusion,this method provided a technical support for laboratory diagnostic and epidemiological survey of TGEV.

transmissible gastroenteritis virus(TGEV)； real-time fluorescence quantitative PCR； specificity； sensitivity

2016-09-26

浙江省公益性研究農業(yè)項目(2016C32065)；金華市重點研發(fā)項目(2014-2-003，2016-2-013)；浙江農林大學人才啟動項目(2012FR047)；浙江省大學生新苗人才項目(2016R412008)

李子祥(1995-)，浙江臺州人，在讀本科生，研究方向：動物預防醫(yī)學。E-mail:526874501@qq.com *表示同等貢獻作者

**通訊作者：宋厚輝(1975-)，山東青島人，研究員，博士，主要從事動物預防醫(yī)學與公共衛(wèi)生方面的研究。 E-mail:songhh@zafu.edu.cn

S855.3

A

1004-3268(2017)03-0129-05