黃籽沙遜與黃籽埃塞俄比亞芥種間雜種的鑒定

譚亞飛，張 強，趙艷艷，許 茜，李 揚，原玉香，姚秋菊，蔣武生，魏小春，王志勇，張曉偉

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

黃籽沙遜與黃籽埃塞俄比亞芥種間雜種的鑒定

譚亞飛1，張 強2*，趙艷艷2，許 茜1，李 揚1，原玉香2，姚秋菊2，蔣武生2，魏小春2，王志勇2，張曉偉2*

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

為了把黃籽沙遜的黃籽性狀同埃塞俄比亞芥菜的優(yōu)良特性相結(jié)合，在對黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥菜種間遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上，開展了對種間雜種的形態(tài)鑒定、染色體倍性檢測、根尖染色體制片和分子標(biāo)記鑒定研究。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，黃籽沙遜和埃塞俄比亞芥菜真雜種外觀明顯不同于其父母本，處于中間類型，更多偏向于父本黃籽埃塞俄比亞芥。總共對 11 株黃籽沙遜與黃籽埃塞俄比亞芥菜種間雜種后代的倍性進(jìn)行了檢測，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，陽性植株DNA相對含量(主峰位置125)明顯小于對照黃籽埃塞俄比亞芥DNA相對含量(主峰位置200)，大于親本黃籽沙遜DNA相對含量(主峰位置75)。細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果表明，真雜種植株染色體為27條，為黃籽沙遜(AA,2n=20)和黃籽埃塞俄比亞芥菜(BBCC,2n=34)的單倍體染色體相加之和。分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，真雜種既有父本也有母本的特異性條帶。以上均證實了所獲得種間雜種的真實性，其包含了雙親中的遺傳信息。所獲得的含有蕓薹屬A、B和C 3個亞基因組的種間雜種可作為育種的中間材料應(yīng)用到甘藍(lán)型油菜的遺傳育種研究，具有重要的理論和實踐意義。

黃籽沙遜； 埃塞俄比亞芥菜； 黃籽； 種間雜種

蕓薹屬植物由3個基本種和3個復(fù)合種組成，遺傳類型極其豐富，變異極其廣泛，其中的許多作物既是重要的蔬菜作物，也是重要的油料作物，在人類的生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著極其重要的作用。種間(遠(yuǎn)緣)雜交可以打破不同種屬間的隔離使之間的基因發(fā)生漸滲和交流，是實現(xiàn)優(yōu)良農(nóng)藝性狀從一個物種向另一個物種轉(zhuǎn)移的重要途徑，在創(chuàng)造新物種或新種質(zhì)以及研究基因組進(jìn)化方面具有重要意義。在蕓薹屬作物中已經(jīng)通過種間雜交創(chuàng)造了許多新的種質(zhì)資源并育成了一些新的品種[1-6]。

埃塞俄比亞芥(BBCC,2n=34)栽培歷史悠久，耐熱，耐干旱，抗倒伏，抗黑痙病、白銹病、霜霉病以及萎蔫病等多種病害[6-8]。由于自然界中不存在天然的甘藍(lán)型黃籽油菜資源，因此，埃塞俄比亞芥菜的黃色種皮基因成為油菜育種家們培育甘藍(lán)型油菜的重要基因資源[9-11]。

白菜型油菜具有甘藍(lán)型油菜所不具有的一些優(yōu)良特性，如較強的抗?jié)裥院涂购裕t播早熟、生育期短。因此可以通過黃籽埃塞俄比亞芥和白菜型油菜黃籽沙遜種間遠(yuǎn)緣雜交來豐富我國黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源。過去已有研究者試圖通過種間雜交將黃籽埃塞俄比亞芥和白菜型油菜的優(yōu)良性狀相結(jié)合，繼而轉(zhuǎn)移到現(xiàn)行推廣的甘藍(lán)型油菜中[12-14]。黃籽沙遜(2n=20)是原產(chǎn)于印度的一個白菜型油菜，種皮顏色金黃、均一，因黃籽性狀十分穩(wěn)定、不受環(huán)境條件的影響而受到育種家的歡迎，被應(yīng)用到白菜型黃籽油菜種內(nèi)雜交育種[15-16]和甘藍(lán)型黃籽油菜的種間雜交育種中[17-18]。

為了把黃籽沙遜的黃籽性狀同黃籽埃塞俄比亞芥的優(yōu)良特性相結(jié)合，構(gòu)建具有蕓薹屬3個基本種基因組的育種中間材料，用于甘藍(lán)型黃籽油菜的遺傳育種研究，在利用黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥種間遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上，開展了對種間雜種的形態(tài)鑒定、染色體倍性檢測和分子標(biāo)記鑒定研究等，為后續(xù)的育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年秋季至2015年春季在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽實驗基地育苗溫室和河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所分子生物學(xué)實驗室進(jìn)行。試驗材料印度白菜型油菜黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥，由加拿大曼尼托巴大學(xué)栗根義教授惠贈，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 種間雜交 2013年秋季，將親本播種于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽試驗田，黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥分別種植，常規(guī)栽培管理；2014年春天開花時，以黃籽沙遜為母本，黃籽埃塞俄比亞芥為父本，剝蕾、去雄、授粉做人工雜交，授粉后套袋隔離，嚴(yán)格控制父本以外的花粉污染。將收獲的黃熟莢果充分干燥，小心脫粒后于室溫貯藏。將經(jīng)過倍性檢測和分子標(biāo)記檢測的植株種植于大田，待2015年春季開花時，觀察記載種間雜種的農(nóng)藝性狀。

1.2.2 倍性分析 2014年秋季，將上述收獲的雜種種子穴盤播種育苗，取其幼嫩葉片約0.5 cm2放于平面玻璃片上，加400 μL一步法染色劑提取液(核提取液)，使用尖銳的刀片用力先縱后橫切割樣品，并浸泡2～5 min，之后將樣本及液體用濾網(wǎng)過濾到樣品管中，再加入1 600 μL的4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染液，避光染色2～5 min。利用德國CyFlow Cube植物流式細(xì)胞儀，按照儀器操作規(guī)程，以黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥的倍性檢測結(jié)果為對照，分析黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥種間雜交植株倍性。

1.2.3 根尖染色體壓片 根尖染色體制片方法參照杜培等的方法[19]。將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，保持濾紙濕潤，25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，待種子胚根長1～2 cm時，用刀片切下根尖部分，用對二氯苯飽和水溶液浸泡預(yù)處理3 h，卡諾氏固定液固定12～24 h，放入-20 ℃冰箱中待用。采用體積分?jǐn)?shù)為45%的醋酸烘烤法制片，經(jīng)過冷凍揭片和DAPI(4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)染色分帶后，滴10 μL VECT shield膠，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下用450～490 nm波長激發(fā)光觀察并照像。

1.2.4 分子標(biāo)記檢測 利用2×CTAB法提取植株的基因組DNA，利用針對白菜型油菜黃籽沙遜黃籽性狀開發(fā)的特異分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增[20]。隨后利用ABI3130 XL遺傳分析儀對PCR產(chǎn)物快速檢測分型，最后利用Genescan和Genographer 軟件分析基因型數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜種種子形態(tài)和植株性狀

雜種種皮顏色為黃色，部分種子淺黃，部分深黃(圖1C)。通過田間種植發(fā)現(xiàn)，黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥真雜種明顯不同于其母本黃籽沙遜(圖1A)和父本黃籽埃塞俄比亞芥(圖1B)，處于中間類型，更多偏向于父本。在營養(yǎng)生長方面，表現(xiàn)為植株高大直立，生長健壯，主莖發(fā)達(dá)，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，葉色濃綠，葉片肥大寬厚無缺刻，葉柄上著生3～4對小葉(圖1D)。雜種在開花期分枝較多，開花正常，花蕾為黃色，蜜腺正常但無花粉，表現(xiàn)為明顯的三倍體雄性不育特征。

A.黃籽沙遜；B.黃籽埃塞俄比亞芥；C.種間雜種種子；D.種間雜種植株

2.2 雜種的倍性鑒定

對11株黃籽沙遜與黃籽埃塞俄比亞芥菜種間雜種的倍性進(jìn)行了檢測(表1)，在以黃籽埃塞俄比亞芥菜作參照，檢測電壓為512 V、閾值為0.092 38的情況下，ysca1—ysca3、ysca5—ysca8和ysca10檢測到DNA相對含量(主峰位置125)(圖2C)，明顯小于對照黃籽埃塞俄比亞芥DNA相對含量(主峰位置200)(圖2A)，大于親本黃籽沙遜DNA相對含量(主峰位置75)(圖2B)，說明這8株都是三倍體，表現(xiàn)為真雜種；而植株ysca4、ysca9、ysca11檢測到DNA相對含量的主峰位置在75，與親本黃籽沙遜DNA相對含量的主峰位置(圖2B)相同，說明這3株為二倍體，為假雜種。

2.3 雜種的根尖染色體數(shù)量檢測

結(jié)果顯示，雜交后代的部分植株的染色體為27條，為黃籽沙遜(2n=20)和黃籽埃塞俄比亞芥(2n=34)的單倍體染色體相加之和(圖3A，B)，這一方面從細(xì)胞水平上證明了所獲得種間雜種的真實性，另一方面也說明了獲得種間雜種為三倍體，這與田間花蕾雄性不育的表型相一致。但也有部分植株部分表現(xiàn)為親本黃籽沙遜的染色體條數(shù)(2n=20)(圖3C)，應(yīng)為種間假雜種，這與倍性分析儀的檢測結(jié)果相符。

表1 11株黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥種間雜種的倍性鑒定結(jié)果

A.黃籽埃塞俄比亞芥； B.黃籽沙遜； C.種間雜種

A，B.種間真雜種； C.種間假雜種

2.4 雜種的分子標(biāo)記鑒定

由圖4可知，ysca1—ysca3、ysca5—ysca8、ysca10這8個植株同時具有黃籽沙遜的A基因組特異條帶(280 bp)、芥藍(lán)或黃籽埃塞俄比亞芥的CC基因組特異條帶(270 bp)以及黃籽埃塞俄比亞芥的BB基因組特異條帶(295 bp)，而ysca4、ysca9和ysca11僅具有黃籽沙遜的A基因組280 bp的特異條帶，這與用倍性分析儀得到的檢測結(jié)果相同。

1—11.黃籽沙遜和黃籽埃塞俄比亞芥種間雜種植株，即ysca1—ysca11；12—13.黃籽沙遜；14—15.芥藍(lán)；16—17.黃籽埃塞俄比亞芥

3 結(jié)論與討論

甘藍(lán)型油菜(AACC，2n=38)是中國油菜的主栽類型，由于長期的品種間雜交和人工選擇，育種親本材料的遺傳背景日漸狹窄，品種的遺傳多樣性明顯降低。油菜籽粒顏色有黑色、褐色和黃色之分。與其他品種相比，黃籽甘藍(lán)型油菜在相同遺傳背景下，黃籽含油量高出3%～5%[21]，種皮薄，餅粕中纖維素含量低[22]而蛋白質(zhì)含量高[23]，且黃籽油色淺，雜質(zhì)少，清澈透明，減少了加工成本等[24-25]。因此，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黃籽油菜已經(jīng)成為當(dāng)前甘藍(lán)型油菜育種的主要目標(biāo)之一。甘藍(lán)型油菜中沒有天然的黃籽類型，但在芥菜型油菜、白菜型油菜和埃塞俄比亞芥中有大量黃籽材料。在本研究中，嘗試把黃籽沙遜的黃籽性狀同黃籽埃塞俄比亞芥的優(yōu)良特性相結(jié)合，成功獲得了黃籽沙遜與黃籽埃塞俄比亞芥的種間雜種。

在蕓薹屬植物的遠(yuǎn)緣雜交中，通常需采用胚和胚珠培養(yǎng)技術(shù)克服雜種胚的敗育，提高雜種效率[26-28]。孟金陵等[29]發(fā)現(xiàn)，埃塞俄比亞芥作母本時雖然較易與白菜型油菜和芥菜型油菜雜交受精，但絕大部分受精胚珠在發(fā)育過程中敗育，很難獲得成熟的雜種種子，而反交中雖然受精頻率下降，但可發(fā)育的受精胚珠較多，因此可交配性提高。本研究中發(fā)現(xiàn)，以黃籽沙遜為母本、黃籽埃塞俄比亞芥為父本時雜交結(jié)實比以黃籽埃塞俄比亞芥為母本、黃籽沙遜為父本的反交容易，這與孟金陵等[29]的研究結(jié)果相符。這種方法不需胚珠培養(yǎng)或子房培養(yǎng)，大大加快了試驗進(jìn)程。本研究以黃籽沙遜為母本、黃籽埃塞俄比亞芥為父本進(jìn)行了蕓薹屬種間遠(yuǎn)緣雜交研究，結(jié)果證明了所獲得種間雜種籽粒為黃色，雜種株具有多倍體植株的營養(yǎng)器官巨大性，但表現(xiàn)為雄性不育，因此應(yīng)為三倍體，對雜種的倍性分析、根尖染色體數(shù)量檢測和分子標(biāo)記檢測也都證明了這一點，獲得的種間雜種具有蕓薹屬A、B、C 3個基因組。江瑩芬等[12]用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)3種方法對黃籽埃塞俄比亞芥和白菜型油菜遠(yuǎn)緣雜交的后代進(jìn)行鑒定，證實了后代的真實性，得到與本研究相類似的結(jié)果，并認(rèn)為形態(tài)學(xué)鑒定在操作上簡單易行。后代的幾種鑒定方法中，分子標(biāo)記鑒定相對于形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定更快更準(zhǔn)確，但在實際生產(chǎn)中可結(jié)合幾種方法同時進(jìn)行。由于本研究獲得的種間雜種為三倍體，在隨后用黃籽沙遜的花粉對三倍體雄性不育株回交授粉時，未能成功結(jié)實；對回交授粉7 d后的胚珠培養(yǎng)也未能獲得成功。在接下來的研究中，需要對三倍體植株進(jìn)行秋水仙素染色體加倍處理，在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定倍性的基礎(chǔ)上，再與黃籽沙遜進(jìn)行回交，以期從雜交后代中選育出甘藍(lán)型黃籽油菜。

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Identification of Interspecific Hybrid between Yellow Sarson and Yellow Seeded Ethiopian Mustard

TAN Yafei1,ZHANG Qiang2*,ZHAO Yanyan2,XU Qian1,LI Yang1,YUAN Yuxiang2,YAO Qiuju2, JIANG Wusheng2,WEI Xiaochun2,WANG Zhiyong2,ZHANG Xiaowei2*

(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Horticulture Sciences,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to combine the yellow seed trait of Yellow Sarson with the fine features of Ethiopian mustard,on the basis of interspecific hybridization experiment between Yellow Sarson and yellow seeded Ethiopian mustard,this study carried out morphological identification,chromosome ploidy detection,slide preparation of chromosomes from root tip cells and molecular marker identification for interspecific hybrids.Morphological identification results of hybrid progeny showed that interspecific hybrids between Yellow Sarson and Ethiopia mustard were very different from their parents and belonged to the middle type in appearance,which were more like the maleparent.The results of ploidy analysis by flow cytometry showed that the peak value of positive plants was 125,which was significantly smaller than the main peak of Ethiopia mustard(200),and bigger than the main peak of Yellow Sarson(75).Cytology identification results showed that the real hybrid plants contained 27 chromosomes,which was the sum of the haploid chromosomes number of the Yellow Sarson(AA,2n=20) and Ethiopia mustard(BBCC,2n=34).Molecular markers identification results showed that true hybrids had specific bands of both male and female parents.The results above indicated that the hybrids were real interspecific hybrids,which contained genetic information from both parents.The created hybrids containing the three subgenomes(A,B and C) ofBrassicacan be used as intermediate breeding materials for application in genetic breeding research ofBrassicanapus,which has important theoretical and practical significance.

Yellow Sarson; Ethiopian mustard; yellow seed; interspecific hybrid

2016-11-17

國家自然科學(xué)青年基金項目(31101558)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項目(2013YQ14)；農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測試驗站項目(河南1020520)

譚亞飛(1987-)，女，河南淮陽人，在讀碩士研究生，研究方向：植物生物工程。E-mail:1021698878@qq.com

*通訊作者：張 強(1976-)，男，河南方城人，副研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳育種工作。E-mail:qiangzh76@163.com 張曉偉(1965-)，男，河南平輿人，研究員，碩士，主要從事蔬菜遺傳育種工作。E-mail:xiaowei5737@163.com

S637

A

1004-3268(2017)03-0107-05