廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-12和DBR-23代謝產(chǎn)物的抑菌活性

劉曉瑩，孫文斌，陳潔萍，卿 朕，周秋艷，鄧業(yè)成

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-12和DBR-23代謝產(chǎn)物的抑菌活性

劉曉瑩，孫文斌，陳潔萍，卿 朕，周秋艷，鄧業(yè)成*

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

研究從廣西地不容塊根中分離出的DBR-12和DBR-23兩株內(nèi)生真菌的抑菌活性，為其在抗菌劑領(lǐng)域的開發(fā)利用提供依據(jù)。首先用液體培養(yǎng)基對內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用兩相溶劑液液萃取法對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，然后用菌絲生長速率法和帶毒平板法分別測定發(fā)酵產(chǎn)物對10種植物病原真菌和15種動(dòng)物致病菌的抑菌活性。結(jié)果表明，DBR-12和DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對植物病原真菌均有較好的抑菌活性。DBR-12對玉米小斑病菌等6種病原真菌的抑制效果較好，有效中濃度(EC50)為0.010 4～0.079 7 g/L，其中對玉米大斑病菌的毒力最高；DBR-23對除玉米小斑病菌外的9種病原真菌抑制效果較好，EC50為0.020 6～0.174 6 g/L，其中對甘蔗鳳梨病菌的毒力最高。DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇萃取物對玉米大斑病菌等5種植物病原真菌的抑制效果較好，EC50為0.107 8～0.646 9 g/L，其中對金橘砂皮病菌的毒力最高。DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對痢疾志賀氏菌等12種動(dòng)物致病菌有抑菌活性，最低抑菌濃度(MIC)為1～2 g/L；DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物對動(dòng)物病原菌無抑菌活性。綜上，廣西地不容內(nèi)生真菌DBR-12和DBR-23有較好的抑菌活性，在抗菌劑領(lǐng)域有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

廣西地不容； 內(nèi)生真菌； 代謝產(chǎn)物； 抑菌活性

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指那些在其生活史中一定階段或全部階段生活在活的植物組織內(nèi)，不引起植物組織產(chǎn)生明顯病害癥狀的真菌或細(xì)菌[1-2]。在內(nèi)生菌與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中，由于內(nèi)生菌與植物間基因交換的結(jié)果，使內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的化學(xué)成分，而且植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的化合物結(jié)構(gòu)類型已遠(yuǎn)超出其植物代謝產(chǎn)物的范圍[3-4]。內(nèi)生菌豐富的次生代謝產(chǎn)物中存在大量的抗腫瘤、抗菌、抗炎和殺蟲等活性物質(zhì)[5-7]，故其對細(xì)菌和真菌有抑制效果，是發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源庫，為天然藥物和無公害農(nóng)藥的開發(fā)開辟了新的途徑，具有重要的研究價(jià)值。廣西地不容(StephaniakwangsiensisLo.)屬防己科千金藤屬多年生草質(zhì)落葉藤本植物[8]，主要分布于廣西西北部和西南部，生長于石灰?guī)r的石山地區(qū)，是廣西壯族等少數(shù)民族常用的草藥。廣西地不容塊根含生物堿3%～4%，具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌作用[9-10]。研究表明，生物堿還具有殺蟲、抗糖尿病等廣泛的生理活性[11-12]。廣西地不容的生長受土壤與氣候的限制而分布范圍窄，因此，從中分離出特殊內(nèi)生真菌，并從內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)的可能性大。目前，國內(nèi)外對廣西地不容內(nèi)生真菌的研究很少，因此，該植物的內(nèi)生真菌資源未能得到充分開發(fā)和利用。研究廣西地不容內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性，對促進(jìn)其開發(fā)利用具有重要意義?，F(xiàn)已從廣西地不容塊根中分離出了多株內(nèi)生真菌，前人僅研究了其中3株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性[13-14]，其他內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性有待繼續(xù)探究。為此，研究從廣西地不容塊根中分離出的DBR-12和DBR-23兩株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性，旨在探究代謝產(chǎn)物抑菌活性效果更好的內(nèi)生真菌，為其在抗菌劑領(lǐng)域的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試植物內(nèi)生真菌：DBR-12和DBR-23均從采自廣西植物研究所的廣西地不容塊根中分離獲得。

供試植物病原真菌有10種：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariaoleracea)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)。其中，金橘砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供，其余由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

供試動(dòng)物病原菌有15種：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、乙型副傷寒桿菌(BacteriumparatyphosumB)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)。所有動(dòng)物病原菌均由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

對照藥物：百菌清(chlorothalonil)原藥由利民化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵 在PDA平板上接種純化保存的DBR-12和DBR-23菌種，待其生長旺盛后，用直徑為0.4 cm的無菌打孔器在菌落平板上切取菌餅，用接種環(huán)挑取3個(gè)菌餅，接種于規(guī)格為1 000 mL、裝有500 mL滅菌馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于溫度為(27±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d，每天搖晃2～3次。

1.2.2 內(nèi)生真菌粗提物的制備 用2層濾紙將內(nèi)生真菌發(fā)酵物進(jìn)行真空抽濾，分為菌餅和發(fā)酵液。將抽濾剩余的菌餅置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃條件下烘干。于錐形瓶中用5倍量的甲醇將粉碎機(jī)粉碎后的菌餅干粉浸泡24 h，期間攪拌2～3次，之后抽濾。重復(fù)浸提3次，合并濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，得菌餅提取物濃縮液。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對抽濾后得到的發(fā)酵液進(jìn)行減壓濃縮，得發(fā)酵濃縮液。最后將菌餅提取物濃縮液和發(fā)酵濃縮液合并，蒸干溶劑，得內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 內(nèi)生真菌粗提物的初步分離 用液液萃取法分離內(nèi)生真菌粗提物。先用蒸餾水溶解粗提物，然后依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇分別萃取5次，合并5次萃取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至膏狀，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及萃余物。

1.2.4 內(nèi)生真菌粗提物的抑菌活性測定

1.2.4.1 對植物病原真菌菌絲生長的抑制活性 參照鐘慧等[15]的菌絲生長速率法測定。先測定質(zhì)量濃度為5 g/L的DBR-12和DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長72 h的抑制率，篩選出各自抑菌效果較好的病原真菌，然后分別配制6個(gè)系列質(zhì)量濃度的藥液，測定其對選定病原真菌的抑制率，用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、有效中濃度(EC50)及EC50的95%置信限。以百菌清為藥物對照，空白對照組用溶劑代替。

1.2.4.2 對動(dòng)物病原菌的抑制活性 參照萬陜寧等[16]的帶毒平板法測定。先測定質(zhì)量濃度為2 g/L的DBR-12和DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種動(dòng)物病原菌生長24 h的抑制活性，篩選出各自具有抑菌效果的病原菌，然后將樣品配成系列質(zhì)量濃度的藥液，測定其對選定病原菌的最低抑菌濃度(MIC)。陽性對照組用溶劑代替藥液，用于觀察細(xì)菌能否正常生長；陰性對照則涂無菌水，用于觀察培養(yǎng)基、藥液或無菌水是否污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

當(dāng)質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)，2株內(nèi)生真菌不同溶劑萃取物與百菌清對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性差異較大。由表1可知，DBR-12不同溶劑萃取物對供試植物病原真菌菌絲生長的抑制活性不同，乙酸乙酯萃取物對玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗鳳梨病菌和水稻胡麻葉斑病菌的抑制率達(dá)100%；正丁醇萃取物對玉米大斑病菌的抑制率達(dá)100%。DBR-12乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、貢柑鏈格孢菌、水稻胡麻葉病菌的抑制活性和正丁醇萃取物對玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、水稻胡麻葉病菌的抑制活性均高于百菌清。DBR-23不同溶劑萃取物對10種供試植物病原真菌菌絲生長具有不同的抑制活性，乙酸乙酯萃取物對其中除玉米小斑病菌外的9種植物病原真菌抑制率在90%以上；正丁醇萃取物對10種植物病原真菌抑制活性較差，抑制率均低于80%。DBR-23乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、茶輪斑病菌、貢柑鏈格孢菌和水稻胡麻葉斑病菌的抑制活性也明顯高于百菌清。DBR-12和DBR-23萃余物對供試植物病原真菌無明顯抑制活性。

表1 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對10種植物病原真菌菌絲生長的抑制率 %

注：每列數(shù)據(jù)后不同字母表示在5%水平上差異顯著(DMRT)。

2.2 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對植物病原真菌菌絲的毒力

為進(jìn)一步明確2株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，分別測定DBR-12乙酸乙酯萃取物對6種植物病原真菌(抑制率在75%以上)菌絲的毒力、DBR-23乙酸乙酯萃取物對9種植物病原真菌(抑制率在90%以上)菌絲的毒力，同時(shí)測定百菌清對10種植物病原真菌菌絲的毒力，結(jié)果見表2。由表2可知， DBR-12乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌的毒力最高，EC50為0.010 4 g/L，對辣椒炭疽病菌的毒力最低，EC50為 0.079 7 g/L。在該6種供試植物病原真菌中，DBR-12乙酸乙酯萃取物除對玉米小斑病菌的毒力低于百菌清外，其余均高于百菌清。DBR-23乙酸乙酯萃取物對甘蔗鳳梨病菌的毒力最高，EC50為0.020 6 g/L，對煙草黑脛病菌的毒力最低，EC50為 0.174 6 g/L。在該9種供試植物病原真菌中，DBR-23乙酸乙酯萃取物除對煙草黑脛病菌和金橘砂皮病菌的毒力低于百菌清外，其余均高于百菌清。

表2 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物和百菌清對植物病原真菌菌絲的毒力

2.3 DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇萃取物對5種植物病原真菌菌絲的毒力

為進(jìn)一步明確DBR-12正丁醇萃取物的抑菌效果，測定其對玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗鳳梨病菌、煙草黑脛病菌和金橘砂皮病菌(抑制率在80%以上)菌絲的毒力，結(jié)果見表3。由表3可知，DBR-12正丁醇萃取物對金橘砂皮病菌的毒力最高，EC50為0.107 8 g/L，對辣椒炭疽病菌的毒力最低，EC50為 0.646 9 g/L。在該5種供試植物病原真菌中，DBR-12正丁醇萃取物除對甘蔗鳳梨病菌的毒力高于百菌清外，其余均低于百菌清(表2、表3)。DBR-12乙酸乙酯萃取物對玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌和甘蔗鳳梨病菌的抑制活性明顯高于其正丁醇萃取物的活性。

表3 DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物正丁醇萃取物對5種植物病原真菌菌絲的毒力

2.4 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種動(dòng)物病原菌的抑制活性

由表4可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，DBR-23乙酸乙酯萃取物對15種供試動(dòng)物病原菌中除傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌外的12種動(dòng)物病原菌有抑菌活性，其正丁醇萃取物和萃余物均無抑菌活性，表明該菌株的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物的2種溶劑萃取物和萃余物均無抑菌活性。

表4 DBR-12與DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物不同溶劑萃取物對15種供試動(dòng)物病原菌的抑制活性

注：“+”表示有菌生長，“—”表示無菌生長，表5同。

2.5 DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對12種動(dòng)物病原菌的MIC

根據(jù)表4結(jié)果，將DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物配成系列濃度梯度，制成帶毒平板，測定其對12種有抑菌活性動(dòng)物病原菌的MIC，以進(jìn)一步明確其抑菌活性。由表5可知，DBR-23乙酸乙酯萃取物有較高的抑菌活性，其對痢疾志賀氏菌、普通變形桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、白色念珠菌和銅綠假單胞桿菌等8種供試菌的MIC為1 g/L，對炭疽桿菌、溶壁微球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌等4種供試菌的MIC為 2 g/L。

表5 DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對12種供試病原菌的MIC測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究中，DBR-12和 DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抑菌活性，活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯萃取物中。內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物具有廣泛的抑菌活性，這與前人的研究結(jié)果[17-19]相似。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DBR-12乙酸乙酯萃取物僅對植物病原真菌的抑菌活性較好，而DBR-23乙酸乙酯萃取物對動(dòng)植物病原菌均有抑制活性，抑菌譜廣。在5 g/L的質(zhì)量濃度下，DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌、甘蔗鳳梨病菌和水稻胡麻葉斑病菌的72 h抑制率達(dá)100%，對玉米大斑病菌的毒力最高，EC50為0.010 4 g/L；DBR-23乙酸乙酯萃取物對10種供試植物病原真菌中除玉米小斑病菌外的9種植物病原真菌的72 h抑制率在90%以上，對甘蔗鳳梨病菌的毒力最高，EC50為0.020 6 g/L。在2 g/L的質(zhì)量濃度下，DBR-12發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物對動(dòng)物病原菌無抑菌活性，DBR-23對15種供試動(dòng)物病原菌中除傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌外12種動(dòng)物病原菌具有24 h的完全抑制活性，其中對痢疾志賀氏菌、普通變形桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、白色念珠菌和銅綠假單胞桿菌等8種供試菌24 h的MIC均為1 g/L。需要指出的是，本試驗(yàn)證明DBR-12和 DBR-23的乙酸乙酯萃取物對多種供試植物病原真菌的抑菌活性均高于化學(xué)農(nóng)藥百菌清。另外，在為數(shù)不多的對廣西地不容內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的研究中，DBR-12和 DBR-23發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性明顯高于周秋艷等[13]研究的DBR-3和DBR-5的抑菌活性。所以2株廣西地不容內(nèi)生真菌在抑菌劑領(lǐng)域有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景，其活性物質(zhì)及作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究，有望開發(fā)出天然、安全和高效的新型抗菌劑。

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Inhibitory Activity of Metabolites of Endophytic Fungi DBR-12 and DBR-23 fromStephaniakwangsiensisLo.

LIU Xiaoying,SUN Wenbin,CHEN Jieping,QING Zhen,ZHOU Qiuyan,DENG Yecheng*

(College of Life Science,Guangxi Normal University/Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection,Ministry of Education of China,Guilin 541004,China)

The antimicrobial activity of two endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 from tuberous root ofStephaniakwangsiensisLo.was determined in order to provide a basis for their utilization in the field of antimicrobial agent.The endophytic fungi were cultivated in liquid medium to produce metabolites,which were then preliminarily isolated by two-phase solvent liquid liquid extraction method,and the antimicrobial activity of metabolites on 10 plant pathogenic fungi and 15 animal pathogens was measured using mycelial growth rate and poison plate methods.The results showed that acetyl acetate extracts from the fermentation products of endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 had high antifungal activity against plant pathogenic fungi.The median effective concentration(EC50) values of DBR-12 to 6 plant pathogenic fungi includingBipolarismaydisand so on were 0.010 4—0.079 7 g/L,with the highest activity againstExserohilumturcicum; the EC50values of DBR-23 to the 10 plant pathogenic fungi except forBipolarismaydiswere 0.020 6—0.174 6 g/L,with the highest activity againstCeratocystisparadoxa.The n-butyl alcohol extract from DBR-12 fermentation product also exhibited high antifungal activity against 5 plant pathogenic fungi includingExserohilumturcicumand so on,and the EC50values were 0.107 8—0.646 9 g/L,with the highest activity againstDiaporthecitri.The minimum inhibitory concentration(MIC) values of acetyl acetate extract from DBR-23 fermentation product against 12 animal pathogens includingShigelladysenteriaeand so on were 1—2 g/L.Fermentation product of DBR-12 showed no antibacterial activity against animal pathogens.The endophytic fungi DBR-12 and DBR-23 fromStephaniakwangsiensisLo.have good antibacterial activity and exhibit a good developmental prospect in the field of antimicrobial agent.

StephaniakwangsiensisLo.; endophytic fungi; metabolites; inhibitory activities

2016-08-12

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016GXNSFAA380207，2013GXNSFAA019058)；廣西高?？蒲许?xiàng)目(2013YB037)

劉曉瑩(1993-)，女，廣西合浦人，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。E-mail：872047081@qq.com

*通訊作者：鄧業(yè)成(1965-)，男，廣西全州人,教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及植物保護(hù)等研究工作。 E-mail:dyecheng@163.com

S482.2+92

A

1004-3268(2017)03-0075-06