葛陳膠囊對大鼠前列腺增生的防治作用

孫汀，繆云萍，程敏，董文彬，葉小弟，陳愛瑛，鄭高利

（1.杭州佛蓮生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013）

·實驗研究·

葛陳膠囊對大鼠前列腺增生的防治作用

孫汀1，繆云萍2*，程敏2，董文彬2，葉小弟2，陳愛瑛2，鄭高利2

（1.杭州佛蓮生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013）

目的探討葛陳膠囊對實驗大鼠前列腺增生的防治作用。方法應(yīng)用尿生殖竇植入誘導(dǎo)雄性SD大鼠前列腺增生模型，隨機分為三組：BPH模型組，葛陳膠囊高、低劑量組，另設(shè)假手術(shù)組。假手術(shù)組和BPH模型組灌胃去離子水，葛陳膠囊組按體質(zhì)量灌胃葛陳膠囊混懸液高劑量1400mg/kg、低劑量700mg/kg，連續(xù)給藥28天，給藥后每周稱大鼠體質(zhì)量，實驗結(jié)束取大鼠血清，檢測血清酸性磷酸酶活性；測定前列腺體質(zhì)量及體積；光鏡下觀察前列腺液卵磷脂小體密度和前列腺組織形態(tài)，同時結(jié)合圖像分析軟件進行前列腺組織形態(tài)計量學(xué)分析。結(jié)果BPH模型組大鼠前列腺體積、體積指數(shù)、體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)顯著增加，卵磷脂小體密度明顯減少、前列腺組織間質(zhì)面積比例明顯增加（P＜0.01）；葛陳膠囊顯著降低大鼠前列腺體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)、體積和體積指數(shù)，部分恢復(fù)前列腺液卵磷脂小體密度（P＜0.01），并能降低前列腺組織間質(zhì)面積和比例、間質(zhì)面積/腺體面積比例（P＜0.05）；各組血清酸性磷酸酶活性無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論葛陳膠囊對實驗大鼠前列腺增生具有防治作用。

葛陳膠囊；尿生殖竇；前列腺增生；形態(tài)計量學(xué)

良性前列腺增生（Benign Prostatic Hyperlasia，BPH）是老年男性的常見病，隨著我國人口的老齡化，患者人數(shù)逐年增加，其臨床表現(xiàn)為排尿費力、尿線變細、尿頻、尿急等，嚴重影響人們的生活質(zhì)量。臨床主要采用手術(shù)和藥物等方法，手術(shù)治療有很大的風(fēng)險性，藥物療效不穩(wěn)定、有不良反應(yīng)等，使藥物治療常受到諸多限制。目前BPH的復(fù)方制劑日益受到關(guān)注，本研究以尿生殖竇植入誘導(dǎo)雄性SD大鼠前列腺增生模型，探討葛陳膠囊對大鼠前列腺增生的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠43只，6個月齡，體質(zhì)量420～470g；清潔級SD孕鼠10只，懷孕19～20天，體質(zhì)量400～450g，動物由浙江省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2009-0039，使用許可證：SYXK（浙）2011-0166；在浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（23±2）℃，相對濕度60%～65%，攝食、飲水自由。

1.1.2 試劑與儀器 葛陳膠囊（杭州佛蓮生物技術(shù)有限公司），臨用時葛陳膠囊高劑量用去離子水配成14000mg/100mL，低劑量用去離子水對半稀釋；注射用青霉素鈉 （華北制藥股份有限公司），批號01108101；戊巴比妥鈉（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司），批號027K0752；酸性磷酸酶檢測試劑盒（上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司），批號 P1202021。LIBRORAEL-200電子分析天平（日本imadzu公司）；Motic生物顯微圖像攝影系統(tǒng)和MoticAdverse3.2形態(tài)分析軟件（廈門麥克奧迪公司）；HM355S組織切片機（德國MICRO公司）；Mindray BA-88A型半自動生化分析儀（深圳邁瑞公司）。

1.2 方法 前列腺增生大鼠模型的制備及分組。麻醉已孕大鼠，無菌操作取出胎鼠，在體視顯微鏡下打開腹腔，取固有尿生殖竇，冷藏于4℃含抗生素及小牛血清的無菌RPMI 1640培養(yǎng)液中，3小時內(nèi)備用。另取雄性SD大鼠43只，隨機分為假手術(shù)組10只和造模組33只，大鼠麻醉后打開腹腔，造模大鼠在膀胱腹側(cè)的前列腺組織內(nèi)植入完整尿生殖竇組織2個，假手術(shù)組僅用針頭探刺前列腺2次。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3天，造模組隨機分為三組，每組11只，即BPH模型組、葛陳膠囊高、低劑量組。葛陳膠囊高、低劑量組分別按1400、700mg/kg體質(zhì)量給藥，假手術(shù)組和BPH模型組灌胃等體積去離子水，灌胃1次/d，連續(xù)28天。

1.3 觀察指標及檢測 觀察各組大鼠的活動狀況、精神狀態(tài)、毛色、食飲量、排便、體質(zhì)量等情況。大鼠末次給藥后24小時，麻醉大鼠，眼眶取全血分離血清，按試劑盒說明檢測酸性磷酸酶活性。剝離前列腺組織，取前列腺液隨機選4個視野，100倍光鏡下計數(shù)卵磷脂小體個數(shù)，取平均值。用濾紙吸干前列腺表面血液后稱其重量；參照文獻方法[1]，用排水法測量前列腺體積的變化。前列腺重量指數(shù)=前列腺重量（mg）/體質(zhì)量（g），前列腺體積指數(shù)=前列腺體積（μL）/體質(zhì)量（g）。前列腺用甲醛固定，石蠟切片，常規(guī)HE染色，鏡下觀察各組前列腺組織結(jié)構(gòu)，每張切片隨機捕獲2個視野（每個視野面積1480μm2），用Motic Adverse 3.2圖像處理分析系統(tǒng)，畫出前列腺腺管輪廓，系統(tǒng)則自動產(chǎn)生此腺管（上皮外周）的面積和周長，計數(shù)視野內(nèi)的腺管數(shù)量（在視野周邊有部分腺管不完整，則統(tǒng)一作為0.5個腺管計）。計算其它指標：（1）腺管面積比例=腺管面積/視野面積 （1480μm2）×100%；（2）間質(zhì)面積（μm2）=視野面積（1480μm2）-腺管面積；間質(zhì)面積比例=間質(zhì)面積/視野面積 （1480μm2）× 100%；每個腺管平均面積（μm2）=腺管面積/腺管數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 各組大鼠手術(shù)后1～2天，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)泛黃且光澤減弱。經(jīng)過后期給藥和常規(guī)飼養(yǎng)，假手術(shù)組和葛陳膠囊組大鼠精神狀況較好，毛色有光澤，行動敏捷，大、小便正常；BPH模型組大鼠反應(yīng)較遲鈍，毛色光澤較暗。各組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增長，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 葛陳膠囊對BPH模型大鼠體質(zhì)量的影響（s，g）

表1 葛陳膠囊對BPH模型大鼠體質(zhì)量的影響（s，g）

組別 n 0d 7d 14d 21d 28d假手術(shù)組 10 449±16 463±20 499±21 512±23 520±22 BPH模型組葛陳膠囊組高劑量低劑量11448±23481±27506±26518±30527±30 11 11 447±16 447±20 461±20 462±25 488±25 496±30 497±28 502±31 507±26 515±28

2.2 對大鼠血清ACP活性和前列腺液卵磷脂密度的影響 各組大鼠血清ACP活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，BPH模型組前列腺液卵磷脂密度明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與BPH模型組比較，葛陳膠囊組卵磷脂密度增加，高劑量組尤為明顯，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表2。

2.3 大鼠前列腺重量和重量指數(shù)、體積和體積指數(shù)的比較 與假手術(shù)組相比，BPH模型組大鼠的前列腺重量和重量指數(shù)、體積和體積指數(shù)均顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明模型制備成功；經(jīng)藥物干預(yù)后，葛陳膠囊能顯著降低BPH模型組大鼠前列腺組織的上述指標。見表3。

表2 葛陳膠囊對BPH模型大鼠血清ACP活性和卵磷脂小體密度的影響（s）

表2 葛陳膠囊對BPH模型大鼠血清ACP活性和卵磷脂小體密度的影響（s）

與BPH模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較△△P＜0.01

組別 n 血清ACP（U/L）卵磷脂小體密度（個）假手術(shù)組 10 4.36±2.25 10.80±2.35 BPH模型組 11 6.01±1.48 4.87±1.46△△葛陳膠囊組高劑量低劑量11 6.27±4.38 6.64±1.60**11 5.69±3.26 6.20±1.70*

表3 葛陳膠囊對BPH模型大鼠前列腺重量和重量指數(shù)、體積和體積指數(shù)的影響（s）

表3 葛陳膠囊對BPH模型大鼠前列腺重量和重量指數(shù)、體積和體積指數(shù)的影響（s）

與BPH模型組比較**P＜0.01；與假手術(shù)組比較△△P＜0.01

組別 n 重量（mg） 重量指數(shù)（mg/g） 體積（μL） 體積指數(shù)（μL/g）假手術(shù)組 10 1260±117 2.47±0.29 1154±92 2.26±0.24 BPH模型組 11 1528±202△△2.96±0.46△△1380±165△△2.72±0.38△△葛陳膠囊組高劑量低劑量11 11 1203±115**1245±182**2.43±0.24**2.49±0.39**1089±110**1165±178**2.21±0.22**2.33±0.38**

2.4 對大鼠前列腺形態(tài)結(jié)構(gòu)和形態(tài)計量學(xué)的影響

假手術(shù)組腺體排列緊密，間質(zhì)纖維不明顯，腺上皮細胞呈單層立方柱狀，部分有較小乳頭狀內(nèi)突；BPH模型組出現(xiàn)非常明顯的間質(zhì)增生，腺上皮較多乳頭狀內(nèi)突，腺腔形狀不規(guī)則；葛陳膠囊高劑量組間質(zhì)增生明顯減少，部分腺體腺上皮細胞乳頭狀內(nèi)突；葛陳膠囊低劑量組間質(zhì)增生減少，腺體大小不勻。見圖1。由表4顯示，各組前列腺腺管的平均面積和每視野的腺管總數(shù)未見明顯差異，說明前列腺腺管無明顯擴張。與假手術(shù)組比較，BPH模型組大鼠前列腺組織間質(zhì)面積比例明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與BPH模型組比較，葛陳膠囊組明顯降低間質(zhì)面積和比例及間質(zhì)面積/腺管面積比例，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 葛陳膠囊對BPH模型大鼠前列腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（1A：假手術(shù)組；1B：BPH模型組；1C：葛陳膠囊高劑量組；1D：葛陳膠囊低劑量組）（HE×100）

表4 葛陳膠囊對BPH模型大鼠前列腺形態(tài)計量學(xué)的影響（s）

表4 葛陳膠囊對BPH模型大鼠前列腺形態(tài)計量學(xué)的影響（s）

與BPH模型組比較*P＜0.05；與假手術(shù)組比較△△P＜0.01

組別 n 間質(zhì)面積（μm2） 間質(zhì)面積比例（%） 腺管面積（μm2）假手術(shù)組 10 568±93 38.4±6.3 912±93 BPH模型組 11 699±108△△47.3±7.3△△781±108△△葛陳膠囊組高劑量低劑量11 11 598±119*615±100*40.4±8.0*41.6±6.8*882±119*865±100*

續(xù)表4

3 討論

良性前列腺增生癥（又稱前列腺肥大），是引起中老年男性排尿障礙中最為常見的一種慢性進展性疾病。其主要表現(xiàn)在組織學(xué)上的前列腺間質(zhì)和腺體成分的增生[2]。中醫(yī)認為BPH主要是濕熱蘊結(jié)、脾腎氣虛、氣滯血瘀，肺、脾、腎三臟功能失調(diào)引起，而補氣助氣、行瘀散結(jié)、通利水道為本病的治療原則[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補腎益氣、活血化瘀、除濕清熱和通利水道藥物能改善人體血液循環(huán)，解除粘連，消除組織增生。

葛陳膠囊，由葛根、陳皮 、黃芩、枳 子、牡蠣、滑石組成。葛根擴張血管和改善微循環(huán)；陳皮理氣健脾、燥濕化痰[4]；黃芩益氣健脾、利尿[5]，臨床有不少報道將黃芩作為主藥入復(fù)方治療前列腺增生，臨床療效良好[6-7]；枳 子味甘性平，降壓利尿、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜[8]；牡蠣軟堅散結(jié)、化瘀散結(jié)[9]、滑石清熱利濕。葛陳膠囊具有行瘀散結(jié)，清熱利濕，通利小便的功效，通過調(diào)節(jié)整體防治和改善前列腺增生，毒副作用小。

人類BPH主要表現(xiàn)為前列腺間質(zhì)增生，包括平滑肌、結(jié)締組織及膠原纖維等基質(zhì)主要組成成分的良性擴張，同時還伴隨著腺腔比例的下降[10]。申青等[11]通過對未分化胎鼠尿生殖竇植入誘導(dǎo)大鼠BPH發(fā)生，應(yīng)用形態(tài)計量學(xué)及免疫組化染色分析前列腺其組織成分變化，結(jié)果顯示該模型與人類BPH的病理特點相似度較高。

本文實驗研究通過復(fù)制生殖竇植入誘導(dǎo)大鼠BPH模型，結(jié)果表明各組體質(zhì)量無明顯變化。與假手術(shù)組比較，前列腺增生模型組大鼠前列腺體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)、體積和體積指數(shù)顯著增加，卵磷脂小體密度明顯減少，鏡下觀察和圖像分析軟件檢測顯示前列腺組織間質(zhì)面積比例明顯增加，腺管增生不明顯，模型以間質(zhì)增生為主。模型大鼠經(jīng)藥物干預(yù)后，葛陳膠囊（1400mg/kg、700mg/kg）可顯著降低模型大鼠前列腺體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)、體積和體積指數(shù)，卵磷脂小體密度部分恢復(fù)，明顯降低前列腺間質(zhì)的面積和比例及間質(zhì)面積/腺管面積比例，但對大鼠前列腺腺管的平均面積和每視野的腺管總數(shù)無明顯影響。

前列腺增生以前列腺組織體積增大為關(guān)鍵特征，前列腺體質(zhì)量和體積直接反應(yīng)前列腺增生程度，是最客觀的指標。本文實驗研究顯示葛陳膠囊對尿生殖竇植入致大鼠前列腺增生模型的體質(zhì)量、體積、間質(zhì)增生有較好的抑制作用。綜上所述，葛陳膠囊對前列腺增生大鼠前列腺具有一定的防治作用，為葛陳膠囊治療人類前列腺增生提供了理論依據(jù)。

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*為通訊作者，E-mail:miaoyp70@163.com