氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物肝臟中β—受體激動(dòng)劑殘留

姚德祥+杜作東+黎小鵬

摘要 研究了動(dòng)物肝臟中3種β-受體激動(dòng)劑（包括鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺）殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)乙酸銨、乙酸乙酯∶異丙醇（6∶4）提取，PCX陽(yáng)離子交換柱凈化，再經(jīng)BSTFA衍生，HP-5MS毛細(xì)管柱分離，基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：3種β-受體激動(dòng)劑在1.0～20.0 μg/L濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不低于0.998，在17.5 min內(nèi)獲得良好的分離，3種β-受體激動(dòng)劑加標(biāo)回收率為85.4%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～10.5%之間（n=6） 。

關(guān)鍵詞 氣相色譜-質(zhì)譜法；動(dòng)物肝臟；鹽酸克倫特羅；沙丁胺醇；萊克多巴胺

中圖分類號(hào) X839.2；TS207.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）23-0244-02

Abstract A Gas Chromatography-Mass Spectrometry method was developed for rapid determination of 3 β-agonists residue（including clenbuterol，salbutamol，ractopamine） in pig liver.The samples were extracted with ammonium acetate，ethyl acetate∶isopropanol（6∶4） and cleaned up by PXC column.The targer compounds were derivatized with BSTFA and detected by GC-MS.A matrix matched internal standard was used for quantitative analysis.The results showed that three β-agonists well separated within 17.5 min.The calibration curves were in good linearity between the peak area and the concentration of 1.0～20.0 μg/L for 3 β-agonists with correlation coefficients not less than 0.998.The spiked recoveries ranged from 85.4% to 106.7% with RSD′s in the range of 4.9%-10.5% （n=6）.

Key words GC-MS；animal liver；clenbuterol；salbutamol；ractopamine

β-受體激動(dòng)劑又叫瘦肉精，是一類結(jié)構(gòu)功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇類衍生物[1]，是一種擬交感神經(jīng)作用藥，具有松弛平滑肌、支氣管擴(kuò)張等作用，常用來(lái)治療支氣管哮喘等疾病[2]。其能夠用來(lái)改善動(dòng)物養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉的合成，抑制脂肪合成的積累，即具有營(yíng)養(yǎng)“再分配效應(yīng)”[3]，被不法商家添加于動(dòng)物飼料中，用以減少動(dòng)物脂肪含量，提高畜禽產(chǎn)品瘦肉率。但是食用含有瘦肉精的畜禽會(huì)嚴(yán)重危害人類健康，我國(guó)已經(jīng)明確將其列入禁用藥品目錄。

目前，有關(guān)β-受體激動(dòng)劑的分析檢測(cè)方法有液相色譜[4]、（氣相、液相）色譜-質(zhì)譜法[5-6]、免疫吸附法[7]等。本文利用固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物肝臟中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行測(cè)定，該方法前處理簡(jiǎn)單，回收率和精密度均較好。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

IKA T18勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司），固相萃取裝置，Ohaus先行者百分之一天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司），Poxwar漩渦混合器（蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），?？频祪x（青島海科儀器有限公司），固相萃取裝置，Agilent 7890A-5977型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。氯化鈉、分析純異丙醇、乙酸乙酯、高氯酸、氫氧化鈉、氨水、乙酸銨，以上均為分析純，均由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；色譜純甲苯由德國(guó)Merck公司生產(chǎn)；衍生劑BSTFA由美國(guó)Supelco公司生產(chǎn)；60 mg 3 mL PCX固相萃取小柱由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)。

鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer，用甲醇將其分別配制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用前用甲醇稀釋成所需濃度的混標(biāo)工作液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取與凈化。將肝臟（豬肝、牛肝）用絞肉機(jī)絞碎后，稱取5.0 g（精確到0.01 g）到50 mL塑料離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)液，10.0 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液，用高氯酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.0±0.2，高速渦旋3 min后，離心（8 000 r/min）3 min，收集上清液到50 mL塑料離心管中，往固體沉淀加入5 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液高速渦旋3 min，再次離心，合并2次乙酸銨提取液。用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至10.0±0.2，離心（8 000 r/min）3 min。

將上清液轉(zhuǎn)移到裝有8 g氯化鈉的100 mL塑料離心管中，加入15 mL乙酸乙酯-異丙醇（6∶4）高速渦旋3 min，離心（8 000 r/min）3 min。提取上層有機(jī)層至15 mL玻璃試管中，氮吹。同時(shí)再加入10 mL乙酸乙酯-異丙醇（6∶4）進(jìn)行第2次萃取，離心后合并所有有機(jī)提取液，繼續(xù)氮吹至近干。加入3 mL（pH=5.2）的乙酸銨溶液，漩渦振蕩后待凈化。

PCX小柱依次用5.0 mL甲醇、2.0 mL水和4.0 mL 30 mmol鹽酸溶液預(yù)淋洗活化，然后倒入上述待凈化液，依次用4.0 mL水、4.0 mL甲醇洗脫，吹干柱中殘液，去掉洗脫液，最后加入5.0 mL氨化甲醇洗脫，用10 mL帶旋塞的玻璃試管收集濾出液。將收集濾出液的試管置于氮吹儀，于55 ℃氮吹至全干，不蓋蓋子在80 ℃烘箱中進(jìn)一步鼓風(fēng)烘干20 min，待試管恢復(fù)至室溫，分別加入100 μL甲苯和100 μL BSTFA蓋上蓋子漩渦混合2 min，于80 ℃烘箱中衍生反應(yīng)1 h，待試管恢復(fù)至室溫，轉(zhuǎn)移至帶有內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.2.2 色譜條件。色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.250 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；載氣及流速：氮?dú)?.8 mL/min；程序柱溫：70 ℃保持0.6 min，以25 ℃/min升溫至200 ℃，保持4 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min；GC/MS傳輸線溫度：280 ℃。檢測(cè)器及溫度：EI離子源220 ℃，四級(jí)桿160 ℃；定量方法：內(nèi)標(biāo)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

試驗(yàn)選用HP-5MS柱作為分析用色譜柱，通過(guò)綜合考慮3種待測(cè)β-受體激動(dòng)劑的理化性質(zhì)，對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的升溫程序進(jìn)行優(yōu)化，得到1.2.2中所述色譜條件，用該條件測(cè)得3種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（圖1），結(jié)果表明，3種待測(cè)β-受體激動(dòng)劑在17.5 min內(nèi)得到良好分離，能滿足動(dòng)物肝臟中β-受體激動(dòng)劑殘留分析要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，試驗(yàn)采用空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇添加濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/kg，萊克多巴胺添加濃度分別為2.0、4.0、10.0、20.0、40.0 μg/kg。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。3種待測(cè)β-受體激動(dòng)劑均呈良好線性關(guān)系，r2均大于0.998。

2.3 回收率和精密度

按照1.2的提取凈化方法和色譜條件，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在空白肝臟（豬肝、牛肝）樣品中添加3.0 μg/kg（萊克多巴胺6.0 μg/kg）和8.0 μg/kg（萊克多巴胺16.0 μg/kg）2種水平的3種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并進(jìn)行6個(gè)樣品的重復(fù)測(cè)定，3種β-受體激動(dòng)劑的平均加標(biāo)回收率在85.4%～106.7%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～10.5%之間。方法回收率和精密度均能滿足試驗(yàn)要求。

3 結(jié)論與討論

本文建立了氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物肝臟中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的分析方法。該方法簡(jiǎn)單、回收率高，采用PCX小柱可以提高柱層析效率，方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析檢測(cè)的要求，適合于豬肝、牛肝中多種β-受體激動(dòng)劑殘留的測(cè)定。

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