大通道毛細管電泳技術的研究進展

徐 然, 李優(yōu)鑫, 賈菲菲, 王丹丹

(天津大學藥物科學與技術學院，天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

1 引言

自上世紀80年代以來，毛細管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)以其高效、快速、高靈敏度、生物兼容性好、運行費用低、樣品和試劑消耗量少及自動化等優(yōu)勢，已成為當今實驗室常用的分析手段之一，在化學[1 - 3]、生物[4 - 6]、制藥[7 - 8]和臨床[9 - 11]等領域中得到了廣泛的應用。通常CE都是在25～100 μm內徑的通道上展開的，隨著CE在各個領域應用范圍的不斷深入，其窄內徑所造成的劣勢漸為突出，主要表現(xiàn)在樣品的載樣量低，痕量物質的檢測靈敏度低，樣品的半制備和制備困難等，這些都限制了CE的應用范圍。與此同時，復雜物質的分析越來越依賴于日益盛行的多維分析技術以及聯(lián)用技術，而CE的低載樣量卻給樣品的轉移及進一步檢測帶來困難。解決CE這些局限性的有效途徑之一是增大分離通道的內徑，但內徑的增大會引起焦耳熱的增加，使得緩沖液中易產(chǎn)生氣泡，引起電流的波動，降低了分析效率，同時樣品在由焦耳熱引起的較高溫度下易失去活性，降低了分析結果可靠性。為此，科學家們嘗試了降低電場強度、使用低電導率緩沖液、加入有機試劑、引入制冷機制等多種解決焦耳熱問題的方法，逐漸發(fā)展了大通道毛細管電泳(Wide-bore Electrophoresis,WBE)技術。WBE作為CE技術的一個嶄新的發(fā)展方向，具有如下優(yōu)點：(1)載樣量高，檢測靈敏度高，有利于痕量組分的分析。(2)具有半制備或制備樣品的潛力。(3)易于建立多維分析模式，實現(xiàn)樣品全面分析。(4)可與其他分析或鑒定技術進行聯(lián)用，分析復雜樣品。

本文結合本課題組前期在具有制冷技術的WBE[12 - 14]、二維WBE系統(tǒng)[14]、WBE與高效液相色譜聯(lián)用系統(tǒng)[15]中的研究成果，評述了WBE技術、多維WBE技術以及WBE與其他方法聯(lián)用技術等各類大通道毛細管方法，比較了WBE技術與其他常用分析技術的優(yōu)缺點，并展望了WBE技術的發(fā)展趨勢及應用。

2 大通道毛細管電泳技術及其多維和聯(lián)用技術

2.1 大通道毛細管電泳(WBE)技術

2.1.1不具有制冷作用的WBE技術WBE技術作為有效的樣品分離分析以及檢測技術，可以在不制冷的作用下通過采用低電導率緩沖液、低電場強度、添加有機試劑以及采取電色譜模式等方法減少焦耳熱的產(chǎn)生。Minarik等[16]在200 μm內徑的聚乙烯醇涂覆毛細管上，通過使用低電導率的緩沖液進行N-糖基化組分的分離與收集，與150 μm毛細管相比，載樣量增加了300倍。Rodriguez等[17]在低電場強度下用內徑為100 μm或者200 μm毛細管檢測細菌污染，在分離過程中未出現(xiàn)焦耳熱問題。

在不具制冷作用的WBE中，電色譜是另一種容易開展的電泳模式。因為電色譜毛細管內填充了合適的填料，其有效體積減小，電流也隨之降低，并且電色譜緩沖液一般含有較大比例有機溶劑，這可進一步減小電流降低焦耳熱。1974年，Pretorius等[18]首次報道了1.0 mm內徑的大管填充柱，但是未見任何分離結果。1994年，Yan等[19]探索了使用大內徑柱的可能性，他們將3或5 μm的十八烷基鍵合硅膠(ODS)填充至320 μm內徑毛細管柱內，使用低電導率的運行緩沖液，試圖控制電滲流及焦耳熱。1998年，Pusecker等[20]在400 bar的壓力下，將5 μm ODS粒子和10%的3 μm硅膠粒子(丙酮溶液)懸浮液填充到了250 μm毛細管，該柱在低電壓下產(chǎn)生的熱量明顯減少。Chen等[21]在550 μm內徑的半制備毛細管上填充了1.5 μm的ODS粒子，在4 kV分離電壓下，實現(xiàn)了500 nL 8.5 μg紫杉醇和9 μg漿果赤霉素的理想分離。Qu等[22]通過制作內徑2.7 mm 到6.0 mm摻雜石英微粉的干凝膠整體柱，來減小孔隙率及柱子的電流，進而減少焦耳熱的產(chǎn)生。在2.7 mm內徑整體柱中，苯甲醛的理論塔板數(shù)高達52 000/m，檢測限約為0.3 μg/mL。Hu等[23]在改進他們操作[24 - 26]的基礎上，通過原位共縮合苯基三乙氧基硅烷(PTES)和正硅酸乙酯(TEOS)，在530 μm的毛細管內制作了苯基功能化的混合硅整體柱。該整體柱可以成功的從可樂樣品中提取雙酚A(BPA)，且檢測限達1.8 ng/mL。

雖然以上方法有效減少了焦耳熱，但這些方法都是減少焦耳熱產(chǎn)生的手段，未考慮從根本上及時原地的帶走電泳過程中產(chǎn)生的焦耳熱，隨著使用次數(shù)和使用時間的增加、管徑的繼續(xù)增大，大管內部會蓄積熱量，電泳的分離分析仍受到不可忽視的影響。對于填充柱更存在制備重現(xiàn)性差，制備過程復雜，分析結果可重復性較差等問題。因此，新的控制焦耳熱的方法仍在探索中。

2.1.2具有外制冷作用的WBE技術外制冷作用是通過在大管的外部采用一些方法，如液冷控溫、風冷控溫、固體接觸控溫等以加速傳遞焦耳熱，從而及時除去焦耳熱。Hjertien等[27]報道了將200 μm內徑的玻璃管放入到溫度20 ℃的水中進行主動冷卻來迅速消散電泳過程中產(chǎn)生的焦耳熱，在短時間內成功地分離了腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶，并獲得了高的分辨率。自那之后，Yin等[28 - 29]報道了用強制空氣冷卻來控制毛細管的溫度為25 ℃。結果表明：在25 ℃時，180 μm毛細管內的溫度可與75 μm毛細管溫度基本一致。同時，未見兩者之間明顯的譜帶展寬，這表明控制溫度后內徑增大基本不會影響重組人生長激素的胰蛋白酶消化肽的分離。Riekkola等[30]通過將分離毛細管插入到一段塑料管內控制了毛細管的溫度，即通過將一個盤繞的銅管浸入水中使空氣冷卻到22 ℃，通過將上述冷空氣引入塑料管中消除焦耳熱，即使使用530 μm內徑的管道也可以使布美他尼和利尿酸得到很好的分離。在控制毛細管溫度為25 ℃下，Oukacine等[31]應用等速電泳模式在內徑為200 μm的大管中進行了高靈敏度革蘭氏陰性菌的定量分析，在不添加任何熒光染料的情況下，檢測限可達到3 000 cells/mL，該方法可以較容易的應用到水樣中細菌的定量檢測。Karger等[32]嘗試了將內徑為50～200 μm的毛細管與半導體致冷器件直接接觸的方法消散產(chǎn)生的焦耳熱，成功控制了毛細管的溫度。

1998年，Riekkola等[30,33 - 34]采用非水介質代替含水緩沖液，同時通過外部水制冷不僅可以控制毛細管溫度在20 ℃，還可以使自動進樣器的溫度低于20 ℃，可以減少樣品和緩沖液的揮發(fā)。他們通過研究20 mmol/L 乙酸銨的乙醇-乙腈-乙酸(50∶49∶1，V/V)緩沖液這一非水介質對CE分離的影響，證實了有機溶劑比水溶液更適于半制備用途的WBE[33]。進一步研究[34]證明C1～C5的醇類可以添加到非水介質中使用。如：含20 mmol/L乙酸銨的正丁醇-乙腈-乙酸(50∶49∶1,V/V)溶液作為緩沖液可分離地匹哌酮、美沙酮、鎮(zhèn)痛新、左啡諾和二氫可待因，當毛細管內徑從50 μm增加到200 μm時，載樣量增加了16倍，當毛細管內徑從50 μm增加到320 μm時，載樣量增加了41倍。雖然非水電泳緩沖液的離子強度很低，電流很小，所產(chǎn)生的焦耳熱也小的多，并且由于其采用了外部制冷，進一步減少了焦耳熱，使得采用更大孔徑的毛細管成為可能，但實際中很多樣品不適合非水環(huán)境下進行分析，限制了該技術的應用范圍。

這種外部制冷的方式也被引入到大管電色譜中。Angus等[35]將1.5 μm反相無孔硅膠裝入254 μm毛細管內制備了整體柱，并通過外部控溫將整體柱恒溫在25 ℃，從而實現(xiàn)了極性不帶電藥物高效快速的分離。采用外部制冷方式能在一定范圍有效消散焦耳熱，其中風冷制冷和液冷制冷已普遍應用。但該方式也有其局限性，如需添加外部設備，運行成本升高。

2.1.3具有內制冷作用的WBE技術隨著WBE技術的發(fā)展，內制冷技術也引入到WBE技術中。例如，Liu等[36]提出了帶有內制冷機制的WBE系統(tǒng)，即在大通道毛細管內插入一根通有制冷介質的毛細管，循環(huán)的制冷介質可以將電泳過程中產(chǎn)生的熱量及時帶走。該系統(tǒng)初步證明了具有內制冷機制的WBE可以有效地去除焦耳熱，比傳統(tǒng)的CE方法更能有效地耐受高電流。

2.1.4具有內外制冷作用的WBE技術在上述研究的基礎上，一些研究者進行了具有內外制冷的WBE技術的研究。例如，我們課題組[14]在之前研究的基礎上[12 - 13]進一步改進了WBE系統(tǒng)。即在內制冷毛細管的兩端套用大小合適的中空纖維管(內徑/外徑：0.69/1.00 mm，長度：0.60 cm)，使其固定在大管內部軸向中心位置，從而避免了由于重力造成的偏離，并且外部控溫以及內制冷毛細管的引入可及時帶走產(chǎn)生的焦耳熱。改進的WBE系統(tǒng)與之前隨機固定內制冷毛細管的WBE相比，對6種有機酸包括對甲苯磺酸、鄰碘苯甲酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和煙酸的分離得到了有效改善。

在毛細管電色譜(CEC)中常會出現(xiàn)堵塞和氣泡的問題，所以整體柱的制作不易。我們課題組[37]同時研究了大管電色譜系統(tǒng)。在1.2 mm石英管內制作了聚丙烯酰胺整體柱，該大管電色譜系統(tǒng)同時具有內、外制冷。在只有外制冷的情況下，可觀察到電流與電壓之間的關系明顯偏離歐姆定律。相反，當同時使用內外制冷時，在相同的條件下從0～625 V/cm具有良好的線性范圍。該大管電色譜系統(tǒng)成功分離了三種中性化合物硫脲、萘、聯(lián)苯和兩種合成食品染料黃色5號和藍色1號。其中對聯(lián)苯的載樣能力高達3 μg，這是普通CEC載樣能力的幾百倍。當進樣1 μL樣品后，藍色1號的理論板數(shù)達到了55 000/m。本課題組[38]還報道了另一種具有內外制冷的大管電色譜系統(tǒng)，即在1.0 mm石英管內采用自制的氨丙基改性納米顆粒作為運行緩沖液中的偽固定相，使6個芳香酸包括對甲苯磺酸、苯甲酸、苯乙酸、對氨基苯甲酸、扁桃酸和肉桂酸達到了完美分離并獲得了高柱效，同時，載樣量高達1 000 nL。

相比單純外制冷的WBE而言，內制冷技術的引入可以從大管內部進行強行降溫處理，這樣一方面可以從焦耳熱產(chǎn)生的源頭將焦耳熱及時有效的帶走，另一方面還具有消除電泳分離通道中徑向溫度梯度的作用，載樣量也由nL級提高到μL級(內徑1 mm)。此外，該WBE系統(tǒng)可以較自由選擇電泳條件，即該技術并不是抑制焦耳熱的產(chǎn)生，而是加速焦耳熱的消散，因此擴大了WBE技術的應用范圍。

2.2 基于WBE的多維分離分析技術

隨著生命科學的發(fā)展，需要分析的樣品越來越復雜，一維的分離技術難以滿足要求，急待開發(fā)出適用的高分辨分離技術。我們課題組[15]對一種結合CE的多維WBE系統(tǒng)進行了初步研究。該系統(tǒng)集分離、轉移、反應、檢測和儲存于一體。在該多維系統(tǒng)中，轉移毛細管和石英大管之間有足夠的直徑差，因此很容易在兩種管之間建立零死體積接口。通過合理地控制轉移電壓，目標物可以順利地轉移至第二維進行進一步分離。該多維系統(tǒng)已成功分離、轉移和二維分離了對甲苯磺酸、苯甲酸、肉桂酸三種帶負電荷的有機酸、α-萘胺和對甲氧基苯胺兩個帶正電荷的有機堿和細胞色素C、溶菌酶和核糖核酸酶A三種帶正電荷的蛋白質。此外，該多維WBE系統(tǒng)還成功在線和離線測定了堿性磷酸酶(ALP)的催化反應，該酶與阻塞性黃疸、肝癌和膽汁阻塞肝炎密切相關[39 - 40]并廣泛存在于人體中[41 - 42]。

2.3 基于WBE的聯(lián)用技術

2.3.1WBE技術與高效液相色譜(HPLC)的聯(lián)用我們課題組[14]報道了將反相高效液相色譜(HPLC)和WBE系統(tǒng)進行串聯(lián)所形成的正交聯(lián)用系統(tǒng)(2D HPLC-WBE)，通過分離苯甲酸和苯乙酸對離線和在線模式進行了評價。在離線2D-HPLC-WBE分析中，兩種酸經(jīng)C18柱分析后收集的餾分可直接進行WBE分析而不需要任何濃縮、干燥和復溶過程。在線2D-HPLC-WBE分析中，色譜系統(tǒng)與電泳系統(tǒng)通過自制的具有400 nL體積定量環(huán)的六通閥進行直接連接，相比單一的HPLC或WBE分析，苯甲酸和苯乙酸在在線2D-HPLC-WBE系統(tǒng)中能得到更好的分離。

2.3.2WBE技術與核磁共振(NMR)的聯(lián)用Pusecker等[20]報道了250 μm毛細管電色譜與NMR的在線聯(lián)用。毛細管的一端插入進樣裝置，另一端通過聚四氟乙烯管與核磁共振探針相連。過量的苯甲酸烷基酯包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基苯甲酸酯通過電驅動進入毛細管，在20 kV電壓和8 bar壓力下用2 mmol/L硼酸鹽的D2O/CD3CN(20∶80,V/V)進行分離后進入NMR儀，所有5種苯甲酸烷基酯通過化學位移值完成了鑒定。

2.3.3WBE技術與質譜(MS)的聯(lián)用Varjo等[43]成功構建了一個液結型接口來聯(lián)用非水型WBE與質譜(MS)。這個接口是將一個薄的噴霧毛細管插入大管內進行連接的。樣品和緩沖液通過水浴冷卻至25 ℃，毛細管通過空氣制冷毛細管盒保持在相同的溫度。脫氧麻黃堿、阿普洛爾和左啡諾作為模型化合物驗證接口的可行性和穩(wěn)定性。對于200 μm內徑的大管塔板數(shù)可介于20 000/m和80 000/m之間，對于320 μm內徑大管塔板數(shù)介于3 000/m～10 000/m之間，模型化合物的檢測限達到35～265 μg/mL。雖然這個接口比較容易維護，但它制備繁瑣，還需要進一步的發(fā)展以提高其可靠性。

Tomás等于2010年報道了WBE與MS的聯(lián)用[44]，他們用一根短的毛細管將大管分離區(qū)與MS儀相連，短的毛細管作為輸送通道以及無鞘電噴霧接口的電噴霧電離(ESI)尖端。樣品先在恒定電流300 μA下，在0.8 mm的預分離毛細管中進行預分離，然后通過在特定時刻切換電流，區(qū)域中的一部分組分被帶入到第二個0.3 mm的毛細管中進行進一步分離，分離后的等速電泳(ITP)區(qū)域通過噴霧液被在線轉移到MS儀。該儀器進行了全血中維生素的分析以及胰蛋白酶消化肽的分離測定，具有高載樣量和快速洗脫的優(yōu)點。

聯(lián)用技術的發(fā)展為復雜樣品的分析分離帶來了希望，通過將多個不同機制的技術進行結合，可以使復雜樣品中不同性質的組分得到高效、快速、高分辨率的分離及分析。但接口問題是聯(lián)用技術中的關鍵，還有待于進一步的研究。

3 大通道毛細管電泳技術與其他技術的比較

3.1 與CE的比較

WBE與CE相比最顯著優(yōu)點是WBE不僅是一種分析技術，而且通過采用大內徑石英管在與CE相似分離效率的基礎上明顯增大了載樣量，大大提高了檢測靈敏度。此外，WBE系統(tǒng)具有較大的分析范圍，從小分子物質如酸、堿、中性物質到大分子物質如氨基酸、蛋白質、核酸、甚至細胞等。并且，WBE系統(tǒng)可以將進樣、分離、檢測、轉移、進一步第二維分離、檢測于一體，是一種高通量和高性能的方法。

3.2 與平板凝膠電泳的比較

平板凝膠電泳具有平行操作和直接對比樣品的優(yōu)點[45]，還可以防止系統(tǒng)中對流運動，有助于提高分離效率，大多數(shù)生化實驗室可滿足其樣品量需求[46]。然而，目前的平板凝膠電泳系統(tǒng)也有其局限性：凝膠具有散熱問題，降低了效率并且限制了高電場強度的使用；凝膠具有相對強的紫外吸收，使得凝膠上的樣品無法進行紫外檢測；無法定量。對于平行分離多個樣品而言，WBE可與平板凝膠電泳相抗衡。然而，WBE能更方便提供樣品的定量信息[36]，電泳圖上峰的詳細信息，如峰面積、峰高可以很容易地獲得作為定量依據(jù)。與平板凝膠電泳相比，WBE的分離效率更高，分析范圍更廣，定量更方便。

3.3 與HPLC的比較

HPLC是一種應用廣泛、高效、快速的分析方法，根據(jù)色譜柱類型和樣品性質的不同它包括多個分離機制。然而，其在手性化合物、多肽、核酸和蛋白質的分析中還有很大的發(fā)展空間。而WBE在上述樣品的分析中具有很大的潛力，可作為HPLC分析的一種有效替代方法。與HPLC相比，具有多種分離模式的WBE是一種簡單、快速和低成本的方法。此外，樣品制備和預富集不是必要的，因為雜質可以很容易地在電泳中分離[47]。

4 總結與展望

CE作為當前分離效率最高的一維分離技術，在諸多領域得到了人們廣泛的接受和認可。但CE樣品用量少的特點已成為拓展其應用的技術瓶頸，使CE僅限于分析水平，很難實現(xiàn)復雜樣品的進一步研究。WBE的出現(xiàn)解決了載樣量低的問題，但隨之出現(xiàn)的焦耳熱的問題成為限制WBE發(fā)展的關鍵。研究者解決焦耳熱問題的方法不外乎兩種，一種是減少焦耳熱的產(chǎn)生，如降低電壓、加入有機溶劑、使用低電導率緩沖液以及采用電色譜模式等；另一種是加速焦耳熱的傳遞，如引入制冷作用等。這些方法在一定程度上發(fā)揮了作用，但也有各自的局限。通過在大管內部引入內制冷毛細管是一種較為通用的，從根本上解決焦耳熱的方法，值得繼續(xù)研究與發(fā)展。多維WBE技術以及WBE聯(lián)用技術提供了多功能整合的平臺并且有利于對復雜樣品進行進一步分析與研究，有很好的發(fā)展前景。

雖然研究者們?yōu)閃BE的發(fā)展做出了許多努力也取得了很大進步。但也有很多任務需要解決。首先，WBE的應用在未來應擴展到更多的領域。由于擴大了管道內徑，可以分析尺寸較大的物質而不會造成堵塞，如腫瘤細胞等。其次，多維WBE技術需要進一步改進，以獲得更好的分離度和效率，通過轉移多個平行樣品并進行收集以達到半制備或制備目的。此外，基于WBE和其他分離鑒定技術的聯(lián)用技術需要改進以獲得復雜樣品的詳細信息?？梢灶A料建立多功能集成的WBE系統(tǒng)或大管微流控芯片系統(tǒng)將是未來的發(fā)展方向，以將快速分離、分析、在線反應等一系列操作進行整合并實現(xiàn)于單次的運行中。