心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞KATP對(duì)開(kāi)放劑敏感性的變化

呂南英，張昊，羅逍，范茁

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006)

·基礎(chǔ)研究·

心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞KATP對(duì)開(kāi)放劑敏感性的變化

呂南英，張昊，羅逍，范茁

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006)

目的 探討ATP敏感性鉀通道(KATP)在異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)的心肌肥厚中對(duì)開(kāi)放劑敏感性的變化。方法 急性分離SD大鼠心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為正常組、肥大組。正常組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不做其他干預(yù)；肥大組以5 μmol/L的Iso處理24 h，成功誘導(dǎo)了心肌肥大模型。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄兩組開(kāi)放劑吡那地爾誘發(fā)的心肌細(xì)胞膜KATP(sarcKATP)電流密度，采用激光共聚焦顯微鏡記錄兩組開(kāi)放劑二氮嗪誘發(fā)的心肌細(xì)胞線粒體黃素?zé)晒獾鞍椎臒晒鈴?qiáng)度間接檢測(cè)線粒體KATP(mitoKATP)敏感性變化。結(jié)果 正常組心肌細(xì)胞和肥大組心肌細(xì)胞sarcKATP的電流密度分別為(2.98±0.35)、(6.32±1.00)pA/pF，線粒體黃素?zé)晒獾鞍椎臒晒鈴?qiáng)度分別為(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%；兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均< 0.05)。結(jié)論 心肌肥厚時(shí)sarcKATP對(duì)吡那地爾的敏感性增強(qiáng)，mitoKATP對(duì)二氮嗪敏感性減弱。

心肌細(xì)胞；心肌肥厚；ATP敏感性鉀通道；大鼠

ATP敏感性鉀通道(KATP)按其分布的部位分為兩類：分布于細(xì)胞膜上的KATP (sarcKATP)和分布于線粒體膜的KATP (mitoKATP)。KATP受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)節(jié)，當(dāng)ATP濃度下降時(shí)通道開(kāi)放，反之通道開(kāi)放被抑制。研究表明KATP的開(kāi)放是應(yīng)對(duì)缺血、缺氧、心肌肥厚等各種代謝狀態(tài)改變壓力下的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。sarcKATP和mitoKATP通過(guò)不同的機(jī)制參與缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用[1]；mitoKATP的開(kāi)放劑二氮嗪能夠抑制大鼠心肌細(xì)胞去氧腎上腺素引起的心肌肥厚[2]；離心型心肌肥厚sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑克羅卡林的敏感性降低[3]以及心肌肥厚代謝壓力下KATP的活化受損[4]。2016年3～11月本研究利用膜片鉗全細(xì)胞模式記錄sarcKATP電流、激光共聚焦顯微鏡記錄線粒體黃素?zé)晒獾鞍椎臒晒鈴?qiáng)度，分別觀察肥大心肌細(xì)胞sarcKATP和mitoKATP對(duì)吡那地爾和二氮嗪的敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要材料 酶Ⅰ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、50 μmol/L CaCl2。酶Ⅱ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、0.1 mg/mL蛋白酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、200 μmol/L CaCl2。酶Ⅲ：Tyrodes、0.8 mg/mLⅡ型膠原酶、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、600 μmol/L CaCl2。Buffer B：Tyrodes、1.0 mg/mL牛血清白蛋白、1 mmol/L CaCl2。KATP外液：NaCl 137 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、CaCl21 mmol/L、NaH2PO41.2 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、glucose 10 mmol/L。KATP外液中加入硝苯地平(10 μmol/L) 和色原烷醇B(10 μmol/L)分別阻斷鈣電流和內(nèi)向整流鉀電流，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.30～7.40。KATP內(nèi)液：KCl 140 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl21 mmol/L，EGTA 11 mmol/L，Na2ATP 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.20。另有異丙腎上腺素(Iso)、戊巴比妥鈉、肝素、吡那地爾、二氮嗪(Sigma，美國(guó))、二硝基苯酚(Sigma，美國(guó))等。

1.2 心肌細(xì)胞急性分離及心肌肥厚細(xì)胞模型制作 取大鼠26只，用5%的戊巴比妥鈉、肝素(1000 U/kg)腹腔注射后，以75%的乙醇對(duì)胸部皮膚進(jìn)行消毒。迅速開(kāi)腔取出心臟放在4 ℃預(yù)冷的無(wú)鈣臺(tái)式液沖洗后將心臟主動(dòng)脈插于灌流裝置上并逆行灌流無(wú)鈣臺(tái)式液體3～5 min，改用酶Ⅰ消化2 min，再改用酶Ⅱ循環(huán)消化25 min左右，待心臟變軟時(shí)于酶Ⅲ中剪碎，于37 ℃水浴鍋震蕩消化3 min，再于200目金屬篩網(wǎng)過(guò)濾，細(xì)胞濾液500 r/min離心1 min，所得細(xì)胞置于bufferB中沉降。在用層粘連蛋白處理過(guò)的培養(yǎng)皿中加入分離的大鼠心肌細(xì)胞和M199培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為正常組和肥大組。正常組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，不做其他干預(yù)。肥大組以5 μmol/L的Iso處理24 h，檢測(cè)心肌細(xì)胞面積以及膜電容顯著增大，ANP、BNP mRNA表達(dá)顯著升高，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明成功建立心肌肥厚細(xì)胞模型。

1.3 細(xì)胞sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑吡那地爾的敏感性檢測(cè) 在全細(xì)胞記錄模式下，用膜片鉗放大器(HEKA，Lambrecht，德國(guó))記錄KATP電流，采樣頻率為10 kHz。貼有心肌細(xì)胞的玻片放于倒置顯微鏡(Nikon，日本)載物臺(tái)上的浴槽中，玻璃微電極用電極拉制儀(Sutter，Novato，CA)分五步拉制，電極電阻為2～5 MΩ，浴槽中加入1 mL KATP細(xì)胞外液。KATP的刺激程序?yàn)椋恒Q制電壓為-40 mV，刺激脈沖電壓為0 mV，持續(xù)時(shí)間均為500 ms，每隔30 s記錄一次由KATP開(kāi)放劑吡那地爾(100 μmol/L)誘發(fā)的sarcKATP電流密度。

1.4 細(xì)胞mitoKATP對(duì)開(kāi)放劑二氮嗪的敏感性檢測(cè) mitoKATP開(kāi)放會(huì)引起由質(zhì)子泵維持的線粒體膜電位降低，加速呼吸鏈的電子傳遞從而引起線粒體氧化。線粒體的氧化還原狀態(tài)間接通過(guò)線粒體內(nèi)的黃素?zé)晒獾鞍椎臒晒庵祦?lái)表示[5]。暴露在二硝基苯酚的線粒體會(huì)引起ATP合成呼吸鏈解偶聯(lián)，線粒體電勢(shì)消失，導(dǎo)致線粒體的最大氧化。因此二氮嗪作用肥大細(xì)胞后，mitoKATP變化后線粒體內(nèi)的黃素?zé)晒獾鞍谉晒鈴?qiáng)度以二硝基苯酚的熒光值的百分?jǐn)?shù)表示[6]。以二氮嗪(300 μmol/L)孵育肥大心肌細(xì)胞15 min，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS,德國(guó))拍攝黃素?zé)晒獬上?，測(cè)定線粒體內(nèi)黃素?zé)晒獾鞍谉晒庵?。最大激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，最大接收波長(zhǎng)為530 nm。用時(shí)間序列模式每隔10 s掃描一次，實(shí)驗(yàn)溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為3%。

2 結(jié)果

2.1 心肌肥厚時(shí)sarcKATP對(duì)吡那地爾的敏感性變化 正常組心肌細(xì)胞和肥大組心肌細(xì)胞sarcKATP沒(méi)有開(kāi)放劑時(shí)都不開(kāi)放。灌流KATP開(kāi)放劑吡那地爾(100 μmol/L)后誘發(fā)出了sarcKATP電流。正常組、肥大組的sarcKATP電流密度分別為(2.98 ± 0.35)、(6.32± 1.00)pA/pF，肥大組的sarcKATP電流密度較正常組升高(P<0.05)。

2.2 心肌肥厚時(shí)mitoKATP對(duì)二氮嗪的敏感性變化 正常細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞mitoKATP在沒(méi)有開(kāi)放劑時(shí)都不開(kāi)放。灌流KATP開(kāi)放劑二氮嗪(300 μmol/L)后，正常組心肌細(xì)胞和肥大組心肌細(xì)胞黃素?zé)晒獾鞍谉晒鈴?qiáng)度分別為(40.10±2.26)%、(21.88±0.17)%，肥大組黃素?zé)晒獾鞍谉晒鈴?qiáng)度較正常組降低(P<0.05)。

3 討論

心肌肥厚是心肌應(yīng)對(duì)各種刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，心肌肥厚導(dǎo)致的心率失常和心肌重構(gòu)是心肌肥厚致死的重要因素。很多研究表明，心肌肥厚過(guò)程中鉀離子通道的活動(dòng)是引起電生理重塑和心率失常的最重要的因素。KATP是一種內(nèi)向整流式鉀通道，主要受ATP濃度調(diào)節(jié)，在生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度為3～4 mmol/L，KATP處于基本關(guān)閉的狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞缺血等病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度低于0.2 mmol/L時(shí)，sarcKATP會(huì)開(kāi)放從而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[7]。近年來(lái)研究表明，KATP開(kāi)放劑在許多動(dòng)物品種上證明起到非常重要的心臟保護(hù)作用，KATP開(kāi)放劑廣泛應(yīng)用于心率失常、心肌缺血、心肌肥厚等各個(gè)領(lǐng)域。KATP開(kāi)放劑吡那地爾可能通過(guò)p70S6激酶依賴性的信號(hào)通路緩解心肌肥厚[8]；二氮嗪通過(guò)開(kāi)放mitoKATP對(duì)去氧腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚具有保護(hù)作用[2]。心肌肥厚時(shí)KATP的開(kāi)放起到了重要的心肌保護(hù)作用，因此，進(jìn)一步研究心肌肥厚中KATP的特性以及潛在的機(jī)制具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞sarcKATP和mitoKATP在沒(méi)有相應(yīng)開(kāi)放劑時(shí)不開(kāi)放，當(dāng)灌流吡那地爾(100 μmol/L)時(shí)，sarcKATP打開(kāi)，心肌肥大組的IKATP電流密度顯著性升高，說(shuō)明肥大心肌細(xì)胞sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑吡那地爾的敏感性增強(qiáng)；當(dāng)二氮嗪(300 μmol/L)孵育15 min后，mitoKATP開(kāi)放，心肌肥大組的二氮嗪誘發(fā)黃素?zé)晒獾鞍椎臒晒鈴?qiáng)度顯著性降低，說(shuō)明肥大心肌細(xì)胞對(duì)二氮嗪的敏感性減弱。

研究表明，蛋白激酶C(PKC)可能通過(guò)降低通道對(duì)ATP抑制位點(diǎn)的敏感性增加sarcKATP活性，蛋白激酶AC(PKA)可能通過(guò)降鈣素相關(guān)基因肽、腺苷、環(huán)前列腺素和β腎上腺受體激動(dòng)劑調(diào)節(jié)sarcKATP活性[9]。心肌肥大時(shí)sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑的敏感性增強(qiáng)，這可能是與心肌肥大時(shí)PKA、PKC的激活有關(guān)。Alvin等[3]研究表明體積超載所致的離心型心肌肥厚降低了sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑克羅卡林的敏感性，而本研究采用Iso通過(guò)β-AR系統(tǒng)誘導(dǎo)心肌肥厚，肥大心肌細(xì)胞sarcKATP對(duì)開(kāi)放劑吡那地爾的敏感性增強(qiáng)，這可能與肥大細(xì)胞類型不同有關(guān)。一氧化氮(NO)供體能夠通過(guò)cGMP信號(hào)通路增強(qiáng)mitoKATP開(kāi)放劑二氮嗪的作用，且PKC活性對(duì)二氮嗪開(kāi)放mitoKATP沒(méi)有影響，代謝抑制時(shí)mitoKATP對(duì)阻斷劑5-HD的敏感性降低[10]。cGMP是心血管系統(tǒng)生理和病理進(jìn)程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)器，生理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞cGMP主要來(lái)源NO激活的可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，心肌細(xì)胞cGMP主要由蛋白激酶G(PKG)調(diào)節(jié)，研究表明cGMP信號(hào)通路在各種心血管疾病中受抑制。mitoKATP對(duì)二氮嗪的敏感性降低可能是心肌肥厚時(shí)cGMP受抑制導(dǎo)致的。

綜上所述，心肌肥厚時(shí)，sarcKATP對(duì)吡那地爾的敏感性增強(qiáng)，其機(jī)制可能與心肌肥厚時(shí)PKA/PKC信號(hào)通路激活有關(guān)。心肌肥厚時(shí)，mitoKATP對(duì)二氮嗪的敏感性降低，其機(jī)制可能與心肌肥厚時(shí)PKG信號(hào)通路受抑制有關(guān)。

[1] Cohen MV, Baines CP, Downey JM. Ischemic preconditioning: from adenosine receptor to KATP channel [J]. Annu Rev Physiol, 2000,62(1):79-109.

[2] Xia Y, Rajapurohitam V, Cook MA, et al. Inhibition of phenylephrine induced hypertrophy in rat neonatal cardiomyocytes by the mitochondrial KATP channel opener diazoxide [J]. J Mol Cell Cardiol, 2004,37(5):1063-1067.

[3] Alvin ZV, Millis RM, Hajj-Mousssa W, et al. ATP-sensitive potassium channel currents in eccentrically hypertrophied cardiac myocytes of volume-overloaded rats [J].Int J Cell Biol, 2011,2011:838951.

[4] Shimokawa J, Yokoshiki H, Tsutsui H. Impaired activation of ATP-sensitive K+channels in endocardialmyocytes from left ventricular hypertrophy [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007,293(6):H3643-H3649.

[5] Liu Y, Sato T, O′Rourke B, et al. Mitochondrial ATP-dependent potassium channels[J]. Circ Res, 1998,97(24):2463-2469.

[6] Fan Z, Wen T, Chen Y, et al. Isosteviol sensitizes sarcKATP channels towards pinacidil and potentiates mitochondrial uncoupling of diazoxide in guinea pig ventricular myocytes [J]. Oxid Med Cell Longev, 2016,2016:6362812.

[7] 朱斌,趙金憲,葉鐵虎.ATP 敏感性鉀通道研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2004,10(8):487-489.

[8] Lee TM, Lin MS, ChangNC. Effect of ATP-sensitive potassium channel agonists on ventricular remodeling in healed rat infarcts [J]. J Am Coll Cardiol, 2008,51(13):1309-1318.

[9] Grover GJ, Garlid KD. ATP-sensitive potassium channels:a review of their cardioprotective pharmacology [J]. J Mol Cell Cardiol, 2000,32(4):677-695.

[10] Wang S, Cone J, Liu Y. Dual roles of mitochondrial KATP channels in diazoxide mediated protection in isolated rabbit hearts [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001,280(1):H246-H255.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31300940)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(2015ZM165)。

范茁(E-mail: fanzhuo@scut.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.17.009

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A

1002-266X(2017)17-0028-03

2016-12-03)