利用CRISPR/CAS9技術(shù)編輯水稻香味基因Badh2

邵高能 謝黎虹 焦桂愛(ài) 魏祥進(jìn) 圣忠華 唐紹清胡培松

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

利用CRISPR/CAS9技術(shù)編輯水稻香味基因Badh2

邵高能 謝黎虹 焦桂愛(ài) 魏祥進(jìn) 圣忠華 唐紹清*胡培松*

(中國(guó)水稻研究所/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；*通訊聯(lián)系人, E-mail： sqtang@126.com, hupeisong@caas.cn)

【目的】香稻作為一類(lèi)特殊的水稻群體，以其清香可口的品質(zhì)特性備受消費(fèi)者的歡迎。到目前為止，水稻中的香味主要受第8染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶基因Badh2控制。【方法】通過(guò)CRISPR/CAS9技術(shù)對(duì)中花11的香味基因Badh2進(jìn)行編輯?！窘Y(jié)果】獲得轉(zhuǎn)基因T0代植株并對(duì)其所衍生的T1代20個(gè)單株進(jìn)行了鑒定分析，獲得了一個(gè)剔除了載體骨架且第1外顯子上插入一個(gè)堿基T 的突變體材料。該材料中Badh2 RNA水平顯著下調(diào)；利用GC-MS技術(shù)測(cè)定野生型及突變體材料籽粒2-乙酰-1-吡咯啉含量，結(jié)果表明突變體材料中的香味物質(zhì)顯著增加；此外，我們還對(duì)野生型及T2代香型植株水稻產(chǎn)量及稻米蒸煮食味品質(zhì)進(jìn)行了考查及測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)除分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率呈現(xiàn)出顯著差異外（P＜0.05），其余各項(xiàng)指標(biāo)在兩組材料間都無(wú)顯著差異?！窘Y(jié)論】通過(guò)CRISPR/CAS9技術(shù)成功地對(duì)水稻香味基因進(jìn)行了編輯，可為香稻育種提供豐富的理論指導(dǎo)，加快香稻的育種進(jìn)程。

水稻；Badh2；CRISPR/CAS9；香味

近些年來(lái)，大量研究報(bào)道了水稻香味基因的研究，主要包括香味基因的遺傳分析，基因的克隆以及香味基因的育種利用等[2-4]。早期研究表明香味基因主要由1～3對(duì)顯性或隱性基因控制[2,4]，隨著研究的深入，遺傳分析結(jié)果表明水稻中香味主要受位于第8染色體上的一個(gè)單隱形基因Badh2控制，該基因編碼甜菜堿脫氫酶[5]，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，共編碼503個(gè)氨基酸，研究表明該基因與香味密切相關(guān)并成功克隆[5-6]。香味物質(zhì)的合成也是香稻研究的重要方面，前人報(bào)道了脯氨酸和鳥(niǎo)氨酸可能為香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的前體物質(zhì)[7]，當(dāng)Badh2突變后導(dǎo)致香味物質(zhì)2-AP含量的大量積累，非香稻材料中該基因所編碼的蛋白甜菜堿脫氫酶可能通過(guò)催化其底物4-氨基丁醛進(jìn)而轉(zhuǎn)化為4-氨基丁酸，而香稻材料中則可能促進(jìn)4-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為1-吡咯啉，進(jìn)而與乙?；鶊F(tuán)結(jié)合，從而形成香味物質(zhì)2-AP，但具體的Badh2蛋白功能及2-AP代謝途徑還沒(méi)有徹底研究清楚[6]。

分子標(biāo)記輔助選擇被認(rèn)為是一種有效的育種手段，特別適合于一些性狀考查比較困難的基因。香味性狀的鑒定相對(duì)比較困難，容易受主觀因素的影響，因此，香味基因分子標(biāo)記輔助選擇可以大大提高其選擇的效率。Badh2第7外顯子8 bp缺失的突變體基因badh2首先被報(bào)道。此外，Chen等[5]還發(fā)現(xiàn)了Badh2另外一個(gè)等位基因，即第2外顯子存在7 bp的缺失，并將有功能的Badh2基因轉(zhuǎn)化到第2外顯子缺失的香稻材料中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的2-AP含量顯著下降，該研究結(jié)果表明第2外顯子上7個(gè)堿基的缺失也可引起水稻香味的產(chǎn)生。此外，隨著香味基因Badh2的克隆[6]，一系列Badh2等位變異基因被成功鑒定，相關(guān)的功能標(biāo)記也被開(kāi)發(fā)利用[8-11]。近些年來(lái)研究人員希望通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)水稻品種中的香味基因進(jìn)行編輯，從而加快育種進(jìn)程。Niu等[12]通過(guò)RNAi技術(shù)，對(duì)日本晴中的香味基因BADH2進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因后代植株中的香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量明顯增加；Chen等[13]采用人工小RNA轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)日本晴中的香味基因BADH2進(jìn)行敲除，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因后代籽粒中2-AP含量明顯提高。轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）是基因組編輯核酸酶，可以有效地對(duì)靶向基因組進(jìn)行編輯，Shan等[14]通過(guò)TALEN技術(shù)，對(duì)水稻香味基因BADH2進(jìn)行基因組編輯，獲得了大約30%的雜合BADH2基因型的遺傳材料，通過(guò)后代分離鑒定，獲得剔除了轉(zhuǎn)基因克隆載體的香型突變體材料，突變體材料的2-AP含量明顯提高。

本研究利用CRISPR-CAS9技術(shù)，以中花11為研究對(duì)象，對(duì)水稻香味基因Badh2進(jìn)行編輯，獲得不攜帶轉(zhuǎn)基因克隆載體及表現(xiàn)出香味的植株，以期為加快水稻香味育種進(jìn)程提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究以中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體，開(kāi)展常規(guī)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因材料種植于中國(guó)水稻研究所富陽(yáng)試驗(yàn)基地，常規(guī)田間種植及管理。

1.2載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究

利用試劑盒快速方便地將gRNA靶點(diǎn)序列插入到Cas9/gRNA質(zhì)粒中。構(gòu)建好的Cas9/gRNA質(zhì)粒能夠同時(shí)表達(dá)植物密碼子優(yōu)化的Cas9蛋白及gRNA，應(yīng)用CRISPR技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因的敲除和編輯，構(gòu)建載體及具體插入位置信息如圖1所示（北京唯尚立德生物科技有限公司）。

在油脂化學(xué)領(lǐng)域，與脂肪酸羧基相關(guān)的反應(yīng)是非常基礎(chǔ)和重要的，其中很多工藝都被大量的運(yùn)用于日常生活當(dāng)中，比如酯化、酰胺化等反應(yīng)；也有一些幾乎不為人所知。所以有必要全面的加以了解，尤其是對(duì)其可發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)應(yīng)該具有一定的宏觀認(rèn)知，這樣有利于在創(chuàng)新上開(kāi)闊思維，擴(kuò)展相關(guān)反應(yīng)在不同領(lǐng)域中的運(yùn)用。

圖1 Cas9/gRNA載體圖Fig. 1. Vector map of Cas9/gRNA.

1.3香味物質(zhì)測(cè)定

香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）含量利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。測(cè)定過(guò)程中采用2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)，將氣體成分以氦氣作為傳送媒介連續(xù)地注射到配置有光離子探測(cè)器的氣相色譜儀，氣相色譜儀與5975質(zhì)量選擇檢測(cè)器連接，其中采用一個(gè)HP-5MS色譜毛細(xì)管柱氣體樣品直接作為離子源，通過(guò)電子碰撞的模式起作用，最后經(jīng)由NIST2005檢測(cè)香氣物質(zhì)的峰值，2-AP的出峰時(shí)間為6.324 min。該方法樣品處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏，樣本和試劑消耗少，能較容易地區(qū)分香稻和非香稻品種，降低了人為判斷香味的主觀性，提高了香味鑒定的準(zhǔn)確性，特別適合大批量香稻育種材料的鑒定，具體方法參考Shan等[14]，并作了相應(yīng)的改進(jìn)。

表1 本研究所使用的引物Table 1. List of primers used in this study.

1.4突變體表型分析

利用中花11及突變體材料，考查株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率及每穗粒數(shù)等產(chǎn)量性狀?？疾?個(gè)單株，獲得數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；千粒重的測(cè)定方法為數(shù)300粒種子并測(cè)定其質(zhì)量，8個(gè)重復(fù)。此外，還對(duì)直鏈淀粉含量，膠稠度及堿消值等三項(xiàng)蒸煮食味品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，3次重復(fù)，獲得的數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5PCR鑒定分析及qRT-PCR分析

分蘗盛期取參試材料單株葉片，采用CTAB法提取全基因組DNA，之后放置于-20℃冰箱中保存。然后將提取的DNA用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，PCR體系如下:DNA 5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1.5 μL，dNTPs（2 μmol/L）10 μL，2×緩沖液 25 μL，KOD Fx酶1 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后EB溶液顯色并拍照，需要測(cè)序的樣品直接切膠回收送上海博尚生物技術(shù)有限公司。

利用RNA 提取試劑盒(Axygen)提取突變體和野生型葉片總RNA。 首先利用DNaseⅠ處理總RNA，接著以消化處理后的RNA為模板，采用cDNA 合成試劑盒(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，然后利用實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)方法分析Badh2在野生型和突變體中的表達(dá)量，其中Ubiquitin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR體系如下: cDNA 模板1 μL，2×SYBR qPCR Mix (TOYOBO) 10 μL，正反引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序如下:95℃下預(yù)變性3 min，95℃下10 s，60℃下30 s，72℃下20 s，45個(gè)循環(huán)。利用公式2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1 結(jié)果與分析

2.1CRISPR-CAS9表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)中花11編碼甜菜堿脫氫酶基因Badh2進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該基因開(kāi)放閱讀框ORF序列與日本晴高度一致，屬于典型的非香型粳稻材料。此外，該材料在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中由于其轉(zhuǎn)化效率高、生育期適中、結(jié)實(shí)率較高等優(yōu)點(diǎn)，因此，我們以中花11為轉(zhuǎn)基因受體，借助CRISPR/CAS9基因敲除技術(shù)開(kāi)展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。首先我們通過(guò)已知的香味基因Badh2登錄號(hào)LOC_Os08g32870，獲得了其全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)合http：//crispr.dbcls.jp/生物信息學(xué)網(wǎng)站，通過(guò)序列比對(duì)分析，在Badh2外顯子上找到一條長(zhǎng)度為20 bp特異性較好的靶點(diǎn)序列Target 1（表1， 圖2-A、B），將其構(gòu)建到表達(dá)載體中（圖1），并開(kāi)展轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

2.2Badh2的編輯及無(wú)標(biāo)記后代的鑒定分析

首先我們獲得了8個(gè)獨(dú)立的T0代轉(zhuǎn)基因植株，我們對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)基因苗提取相應(yīng)的DNA，同時(shí)在表達(dá)載體上設(shè)計(jì)特異性引物Vector-identify-F/R對(duì)靶點(diǎn)序列進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證（表1）。測(cè)序結(jié)果表明，我們驗(yàn)證了靶點(diǎn)序列的載體已成功插入到植物基因組，通過(guò)利用設(shè)計(jì)特異性測(cè)序引物Seq-F/R對(duì)Badh2靶點(diǎn)位置的基因組序列進(jìn)行了測(cè)序分析（表1）。結(jié)果表明，其中3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系材料在PAM附近發(fā)生了編輯，由于兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系沒(méi)有收到足夠的種子，因此僅對(duì)其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行了遺傳研究（圖2-C）。

圖2 Badh2及基因編輯Fig.2. Badh2 and its CRISPR-CAS9-mediated editing.

我們將T1代材料種植到轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)田，通過(guò)DNA提取及載體序列擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)載體在后代中發(fā)生了分離（圖2-D）。此外，我們進(jìn)一步對(duì)T1代植株Badh2進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在Badh2第一外顯子上距離起始密碼子ATG下游18 bp位置插入一個(gè)堿基T，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的移碼，影響了Badh2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能（圖2-B）。通過(guò)對(duì)T120個(gè)單株Badh2編輯位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了該基因突變位點(diǎn)也發(fā)生了分離（圖2-E）。通過(guò)CRISPR-CAS9 技術(shù)對(duì)水稻中的香味基因進(jìn)行編輯，希望獲得剔除了載體骨架，同時(shí)還有香味的遺傳材料，結(jié)合載體序列PCR鑒定和Badh2靶點(diǎn)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單株3中的載體骨架已經(jīng)分離出去，而且還攜帶有突變形式的香味基因badh2(圖2-D、E)。

2.3轉(zhuǎn)基因后代Badh2 RNA水平檢測(cè)及香味物質(zhì)2-AP含量的測(cè)定

前期我們獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因材料badh2，該材料中不包含載體序列且Badh2已被成功編輯，野生型與badh2表現(xiàn)出相似的植株表型(圖3-A)。此外，為了進(jìn)一步研究香味基因在轉(zhuǎn)基因后代中的功能，我們對(duì)中花11和突變體材料中Badh2 RNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。前人已報(bào)道水稻苗期葉片適合于Badh2 RNA 檢測(cè)[5]，因此我們提取了兩組材料苗期14 d左右葉片總RNA，然后通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，對(duì)Badh2進(jìn)行了定量分析，我們發(fā)現(xiàn)突變體材料中Badh2表達(dá)水平顯著降低(圖3-B)。該結(jié)果表明香味基因第1外顯子一個(gè)核苷酸的插入，影響了該基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致該基因在突變體材料中表達(dá)顯著下調(diào)。

圖3 Badh2基因編輯后代表型及RNA表達(dá)水平的檢測(cè)Fig. 3. Phenotype and Badh2 RNA level of ZH11(Zhonghua 11) and badh2.

圖4 中花11及badh2中總離子色譜分析及香味物質(zhì)2-AP的含量Fig. 4. Total ion chromatograms(TIC) and 2-acetyl-1-pyrroline(2-AP)content of Zhonghua 11 and badh2.

與此同時(shí)，我們進(jìn)一步分析了該基因的突變及表達(dá)水平的降低是否與香味的產(chǎn)生相關(guān)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)兩份材料中花11及突變體材料籽粒中的2-AP含量進(jìn)行了分析(圖4-A、B)，與野生型中花11對(duì)照相比，突變體材料中的香味物質(zhì)2-AP顯著提高，中花11中2-AP含量約0.07mg/kg，而突變體中則增加到1.2 mg/kg（圖4-C），因此，我們的結(jié)果表明Badh2突變是引起香味的一個(gè)關(guān)鍵基因。

圖5 水稻產(chǎn)量及蒸煮食味品質(zhì)在野生型及突變體材料中的表現(xiàn)Fig. 5. Performance of rice yield and cooking and eating quality in ZH11 and badh2.

2.4Badh2基因編輯后代產(chǎn)量性狀的考查及蒸煮食味品質(zhì)的測(cè)定

為了研究香味基因是否與水稻產(chǎn)量及稻米品質(zhì)密切相關(guān)，我們對(duì)中花11及其T2代突變體材料中的產(chǎn)量性狀及蒸煮食味品質(zhì)等幾項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了考查及測(cè)定。產(chǎn)量性狀主要包括株高、分蘗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)及結(jié)實(shí)率，而蒸煮食味品質(zhì)主要包括直鏈淀粉含量、膠稠度及堿消值。通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)除了分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率在兩組材料中表現(xiàn)出顯著差異外(P＜0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)間都無(wú)顯著差異(圖5)。因此，通過(guò)以上數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，推斷該基因并不影響稻米品質(zhì)，但是有可能影響水稻的產(chǎn)量。

3 討論

全球香稻資源豐富、栽培歷史悠久、種植范圍分布廣泛，印度的Basmati系列、泰國(guó)的KDML105、日本的宮香、美國(guó)的Della都是頗有名氣的香稻品種。我國(guó)也是香稻的主要種植區(qū)域，種植歷史悠久，各水稻主產(chǎn)區(qū)都有適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂虻脑枷愕绢?lèi)型，如云南的螃蟹谷、貴州的香禾、廣西有靖西香糯等。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，傳統(tǒng)香稻存在地域性強(qiáng)、生育期長(zhǎng)、抗倒伏和抗病能力差、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，使得香稻的推廣和生產(chǎn)應(yīng)用受到了較大的限制[15]。傳統(tǒng)的香稻育種主要通過(guò)香型和非香型品種間雜交，由于后代分離植株香味鑒定的不確定性，以及香味基因可能與一些產(chǎn)量、品質(zhì)或抗病基因存在連鎖累贅，因此成功選育成香型優(yōu)良品種比較困難。

眾所周知，傳統(tǒng)香稻育種還是主要通過(guò)傳統(tǒng)的育種手段，品種間雜交及后代鑒定篩選，需要花費(fèi)大量時(shí)間和精力，因此，前人已嘗試通過(guò)轉(zhuǎn)基因的技術(shù)，直接對(duì)我們所培育品種中的香味基因Badh2進(jìn)行敲除或編輯，從而加快育種進(jìn)程[12-14]。CRISPR-CAS9系統(tǒng)是繼RNAi技術(shù)、鋅指核酸酶和TALEN核酸酶之后最新發(fā)展起來(lái)的另一個(gè)可精確定點(diǎn)編輯基因組DNA的新技術(shù)，其具有設(shè)計(jì)構(gòu)建簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)首先在動(dòng)物中廣泛利用，隨后科研人員將該技術(shù)應(yīng)用于植物基因組編輯。我們通過(guò)在Badh2基因ORF區(qū)域上設(shè)計(jì)特異性靶位點(diǎn)(圖2-A)，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因特異性敲除實(shí)驗(yàn)，成功獲得了一個(gè)攜帶有香味且剔除了載體序列的突變體材料badh2，該基因第一外顯子上發(fā)生了一個(gè)核苷酸T的插入(圖2-B)，不僅導(dǎo)致Badh2 RNA水平顯著降低(圖3-B)，而且引起了該蛋白質(zhì)的移碼，突變后的Badh2不能發(fā)揮正常蛋白功能，進(jìn)而導(dǎo)致了香味的產(chǎn)生(圖4-C)，由于該材料未攜帶轉(zhuǎn)基因元件，可直接應(yīng)用于育種研究，培育新的香型水稻材料，因此，利用該轉(zhuǎn)基因技術(shù)策略及特異性靶點(diǎn)，可以直接對(duì)不同水稻品種的Badh2進(jìn)行編輯，創(chuàng)制香型遺傳材料，這將大大加速香稻品種的選育進(jìn)程。

前人已報(bào)道香味基因與產(chǎn)量、品質(zhì)及抗病性存在一定的關(guān)系，我們通過(guò)對(duì)野生型材料中花11及轉(zhuǎn)基因后代材料的產(chǎn)量及品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)香味基因的變異與稻米品質(zhì)沒(méi)有表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，只有分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率兩項(xiàng)指標(biāo)在中花11及突變體材料中表現(xiàn)出顯著差異，株高、千粒重、每穗粒數(shù)以及三項(xiàng)蒸煮食味品質(zhì)指標(biāo)在兩組材料都無(wú)顯著差異(圖5)。轉(zhuǎn)基因植物容易導(dǎo)致植株變矮，分蘗數(shù)變少及結(jié)實(shí)率降低，所以我們推測(cè)該差異可能歸因于脫靶或轉(zhuǎn)基因過(guò)程中的組織培養(yǎng)，因此，我們目前將對(duì)突變體材料與野生型材料進(jìn)行回交，進(jìn)一步研究香味基因與分蘗數(shù)及結(jié)實(shí)率的關(guān)系。

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CRISPR/CAS9-mediated Editing of the Fragrant Gene Badh2 in Rice

SHAO Gaoneng, XIE Lihong, JIAO Guiai, WEI Xiangjin, SHENG Zhonghua, TANG Shaoqing*, HU Peisong*
(State Key Laboratory of Rice Biology, Key Laboratory of Rice Biology and Breeding of Ministry of Agriculture, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: sqtang@126.com, hupeisong@caas.cn)

【Objective】Fragrant rice, which is favored because of its quality characteristics of faint scent and tastiness, is a special rice type. Fragrance in rice is mainly controlled by the gene encoding betaine aldehyde dehydrogenase on chromosome 8.【Method】The fragrant gene Badh2 in Zhonghua 11 was edited by CRISPR/CAS9.【Result】Twenty T1individuals derived from T0generation were genotyped. One plant, which contains an additional T base in the first exon of Badh2 without the vector skeleton, was finally produced. qRT-PCR result suggested that Badh2 RNA level was decreased in the mutant. Compared with the wild type, the mutant increased 2-acetyl-1-pyrroline content by the GC-MS method. Furthermore, two rice yield-related traits including tiller numbers and seed-setting rate showed significant difference at the 0.05 level among five traits related to yield and three traits related to cooking and eating quality.【Conclusion】We succeed editing the Badh2 by CRISPR-CAS9 technical in rice, and it would provide abundant theoretical guidance and accelerate the breeding process of fragrant rice.

rice; Badh2; CRISPR/CAS9; fragrance

Q755; S511.032

A

1001-7216(2017)02-0216-07

2016-06-20; 修改稿收到日期:2016-09-10。

國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際（地區(qū)）合作與交流項(xiàng)目(31161140348); 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y14C130040)。