厭氧產(chǎn)乙酸菌株ZY—3的篩選、鑒定及產(chǎn)酸條件

習(xí)彥花 張麗萍++崔冠慧++王慧++邢清朝 王雅娜

摘要：為篩選高效厭氧水解產(chǎn)乙酸菌，將其應(yīng)用于高濃度有機(jī)廢水的厭氧生物處理，強(qiáng)化產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)乙酸作用，提高消化效率。采用Hungate厭氧操作技術(shù)以及選擇性培養(yǎng)基分離篩選高效產(chǎn)乙酸菌，經(jīng)生態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列同源性分析對(duì)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸特性進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明，從污水處理廠活性污泥中分離出1株厭氧水解產(chǎn)乙酸菌 ZY-3，經(jīng)鑒定為雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）。該菌株在以麥芽糖為碳源、初始pH值為7.5、30 ℃溫度下培養(yǎng)12 h，乙酸產(chǎn)量最高達(dá)1 346.7 mg/L；在添加0.4 mol/L NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中可正常生長(zhǎng)且產(chǎn)酸量較0、0.2 mol/L NaCl處理增加，高達(dá)1 588.7 mg/L。菌株ZY-3產(chǎn)酸能力強(qiáng)，發(fā)酵性能穩(wěn)定，還能利用丙酸鹽發(fā)酵產(chǎn)乙酸，對(duì)加速乙酸轉(zhuǎn)化、防止丙酸積累、提高厭氧消化效率具有重要意義。

關(guān)鍵詞：活性污泥；雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）；分離鑒定；產(chǎn)酸條件

中圖分類號(hào)： Q939.9；X703文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0526-03

收稿日期：2015-10-28

[JP2]基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：14222901D、14273801D）；河北省財(cái)政預(yù)算（編號(hào)：15302）；河北省青年基金（編號(hào)：C2015302018）。

作者簡(jiǎn)介：習(xí)彥花（1986—），女，河北石家莊人，碩士，助理研究員，主要從事能源微生物及生物質(zhì)資源綜合利用技術(shù)研究。Tel：（0311）83014879；E-mail：xiyanhua86@163.com。

通信作者：程輝彩，博士，副研究員，主要從事生物質(zhì)能源方面的研究。E-mail：huicaicheng@163.com。

高濃度有機(jī)廢水的厭氧生物處理技術(shù)因具有有效、簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)而被全世界廣泛應(yīng)用[1]。然而在厭氧工藝中仍有諸多不足之處，例如由于厭氧細(xì)菌增殖較慢而導(dǎo)致的厭氧反應(yīng)器初次啟動(dòng)過(guò)程緩慢、出水揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，簡(jiǎn)稱VFA）含量較高、大量丙酸積累導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)生酸化等[2-5]。馬超等認(rèn)為，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)乙酸作用是厭氧消化過(guò)程的第一限速步驟，乙酸途徑生成的甲烷約占甲烷生成總量的2/3[6-8]，因此篩選能利用丙酸鹽發(fā)酵產(chǎn)乙酸的高效菌株，強(qiáng)化產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)乙酸作用，是防止丙酸積累、提高厭氧消化系統(tǒng)負(fù)荷率、提高處理效率和運(yùn)行穩(wěn)定性的關(guān)鍵。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)各類發(fā)酵產(chǎn)酸菌群的生理生態(tài)學(xué)研究，尤其對(duì)作為第一限速步驟的產(chǎn)乙酸菌的研究越來(lái)越多[9-10]。

本研究通過(guò)選擇性培養(yǎng)基從污水處理污泥中分離篩選到1株高效厭氧產(chǎn)乙酸菌，對(duì)它進(jìn)行菌種鑒定以及發(fā)酵產(chǎn)酸特性研究，旨在為廢水厭氧處理的生物強(qiáng)化作用提供菌種資源。通過(guò)將其人工接種到厭氧生物處理系統(tǒng)中，以提高厭氧反應(yīng)器中生物持有量，加快產(chǎn)酸發(fā)酵菌群的產(chǎn)物——VFAs和乙醇等轉(zhuǎn)化為乙酸的速率，解除大量因丙酸積累造成系統(tǒng)酸化問(wèn)題，并為產(chǎn)甲烷菌群提供更加豐富的底物——乙酸，增強(qiáng)代謝活性，提高厭氧生物處理效能。

1材料與方法

1.1樣品

從石家莊橋東污水處理廠采集3份活性污泥樣品、5份水樣。

1.2培養(yǎng)基

選擇性培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.25 g/L，酵母提取物 0.5 g/L，蛋白胨0.25 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 1.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，0.1%刃天青指示劑2滴，pH值7.0～7.2。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 15 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，0.1%刃天青指示劑2滴，pH值7.0～7.2。

1.3菌株篩選方法

取1 g泥樣（或1 mL水樣）加入10 mL無(wú)氧滅菌的培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，傳代穩(wěn)定后采用改良Hungate滾管技術(shù)進(jìn)行純菌滾管分離。

1.4菌種鑒定

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)[11-12]和16S rDNA序列比對(duì)進(jìn)行菌種鑒定。

1.5產(chǎn)酸特性

1.5.1培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響

分別測(cè)定在4、16、25、30、37、45 ℃條件下，培養(yǎng)12 h菌株的生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)酸情況。

1.5.2初始pH值對(duì)菌株ZY-3產(chǎn)酸的影響

在最適生長(zhǎng)溫度條件下，分別測(cè)定菌株在初始pH值為5.5、6.0、6.5、70、7.5、8.0、8.5、9.0培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況。

1.5.3不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響

在最適生長(zhǎng)溫度及初始pH值條件下，分別測(cè)定菌株在以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、檸檬酸、甘露醇、甘油、丙酸鈉、丁酸鈉為碳源的培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況。

1.5.4耐鹽性研究

在培養(yǎng)基中分別添加0（CK）、0.2、04、0.8、1.2 mol/L的NaCl，測(cè)定菌株的生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)酸情況，并分析菌株的耐鹽程度。以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.6分析方法

1.6.1菌體濃度測(cè)定

用751紫外分光光度計(jì)，在510 nm處測(cè)定供試樣品的吸光度，作為菌體濃度。

1.6.2液相末端產(chǎn)物分析

乙酸含量的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[13]。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離鑒定

2.1.1菌株的篩選

從污水處理廠活性污泥及水樣中分離得到乙酸產(chǎn)量較高的14株菌株。經(jīng)厭氧發(fā)酵復(fù)篩，獲得1株高效厭氧水解產(chǎn)乙酸菌株ZY-3，乙酸平均產(chǎn)量為 1 110.6 mg/L。

2.1.2菌株的形態(tài)特征

菌株ZY-3在選擇性培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)白色或乳白色，不規(guī)則圓形，不透明。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，菌體呈桿狀[（0.5～0.6） μm×（1.0～3.0） μm]，單個(gè)或短鏈，偶見(jiàn)長(zhǎng)鏈；孢子卵圓形，中到次端生（圖1）。該菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成黏的沉淀。

[FK（W20][TPXYH1.tif；S+3mm]

2.2菌株ZY-3生理生化特征

由表1可見(jiàn)，菌株ZY-3為嚴(yán)格厭氧菌，革蘭氏染色、明膠液化、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)H2試驗(yàn)均為陽(yáng)性；淀粉水解、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性；可利用多種糖如纖維二糖、D-葡萄糖、果糖、麥芽糖等產(chǎn)酸，以丙酸鹽、丁酸鹽等為發(fā)酵底物。

2.3菌株ZY-3的16S rDNA序列測(cè)定與分析

菌株ZY-3經(jīng)PCR擴(kuò)增、16S rDNA序列分析表明，其16S rDNA長(zhǎng)度為1 376 bp。將序列輸入GenBank，以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)所構(gòu)建的包括親緣關(guān)系最近的菌株比對(duì)分析表明，菌株ZY-3屬于梭狀芽孢桿菌屬的雙酶梭狀芽孢桿菌（Clostridium bifermentans）（圖2）。

2.4菌株ZY-3的生長(zhǎng)狀況及產(chǎn)酸特性

2.4.1培養(yǎng)溫度對(duì)菌株ZY-3生長(zhǎng)與產(chǎn)乙酸的影響

由圖3可見(jiàn)，菌株ZY-3最適培養(yǎng)溫度為30～37 ℃。隨著溫度升高，菌體濃度也相應(yīng)增加，37 ℃時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大值；30 ℃ 培養(yǎng)溫度下，乙酸產(chǎn)量最大，為1 364.3 mg/L；溫度高于 37 ℃ 后菌體濃度及乙酸產(chǎn)量快速下降，45 ℃時(shí)基本無(wú)生長(zhǎng)。在12 h培養(yǎng)過(guò)程中，乙酸產(chǎn)量同菌體濃度變化趨勢(shì)基本一致。

2.4.2不同初始pH值對(duì)菌株ZY-3生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響

pH值對(duì)微生物的生理代謝影響很大。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)pH值為7.5時(shí)，菌株ZY-3的菌體濃度最大，與pH值為7.0時(shí)無(wú)明顯差異；菌株ZY-3在pH值7.5時(shí)有最大乙酸產(chǎn)量，為 1 256.1 mg/L，明顯高于pH值為7.0時(shí)的乙酸產(chǎn)量；此后隨著pH值的增加，乙酸產(chǎn)量降低，pH值為9.0時(shí)，菌體被抑制生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，起始pH值在7.5左右時(shí)，菌株ZY-3具有較好的生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)乙酸代謝的生理生化過(guò)程。

2.4.3不同碳源對(duì)菌株ZY-3生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中按3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別添加葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖[CM（25]、淀粉、檸檬酸、甘露醇、甘油、丙酸鈉、丁酸鈉10種碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。由圖5可見(jiàn)，當(dāng)碳源為麥芽糖時(shí)，菌株ZY-3的菌體濃度最大，乙酸產(chǎn)量最高，為1 346.7 mg/L；其次為葡萄糖，乙酸產(chǎn)量為1 204.9 mg/L；檸檬酸、甘露醇、甘油等底物不利于菌株ZY-3的代謝產(chǎn)酸。另外菌株ZY-3能以丙酸鈉、丁酸鈉為唯一碳源發(fā)酵產(chǎn)乙酸，對(duì)解除厭氧消化過(guò)程中由于丙酸積累所導(dǎo)致的系統(tǒng)酸化問(wèn)題具有積極意義。

2.4.4耐鹽性研究

由圖6可見(jiàn)，加入一定量的Na+雖然菌體濃度有一定的降低，但是卻刺激了代謝產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生；隨著Na+濃度的增加，菌體濃度有所下降，在0.8 mol/L時(shí)已經(jīng)幾乎被抑制；乙酸產(chǎn)量卻在Na+濃度為0.4 mol/L時(shí)達(dá)到最大值1 588.7 mg/L，比對(duì)照提高20.8%。說(shuō)明適當(dāng)濃度的Na+可以刺激代謝產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生。

3討論

與好氧技術(shù)相比，高濃度有機(jī)廢水的厭氧生物處理效率更高、運(yùn)行成本更低、剩余污泥少，且能生成甲烷。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)[CM（25]外針對(duì)有機(jī)廢水厭氧消化水解產(chǎn)酸階段的研究越來(lái)越多。[CM）]

[TPXYH6.tif]

強(qiáng)化產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)乙酸作用，解除大量丙酸的積累，成為目前廢水厭氧處理技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。本研究從污水處理廠活性污泥中分離得到的菌株ZY-3（雙酶梭菌，Clostridium bifermentans），具有較高的耐鹽能力，能分解麥芽糖、蔗糖、淀粉等多種底物產(chǎn)乙酸。同時(shí)還能利用丙酸鹽、丁酸鹽等產(chǎn)乙酸，對(duì)解除有機(jī)廢水厭氧消化過(guò)程中大量丙酸積累所造成的系統(tǒng)酸化有一定的積極意義。菌株ZY-3的發(fā)現(xiàn)拓寬了厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙酸菌的范圍，為有機(jī)廢水厭氧消化處理的生物強(qiáng)化手段提供了寶貴的菌種資源，為進(jìn)一步研制微生物強(qiáng)化菌劑提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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