UFLCQTRAPMSMS同時(shí)測(cè)定蟻巢傘屬3種雞中氨基酸核苷含量及PCA分析

張園嬌+胡鵬+馬赟+蔡靜+李月+李祥+陳建偉

[摘要]建立高分離度快速液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UFLCQTRAPMSMS）同時(shí)測(cè)定蟻巢傘屬3種雞中15種氨基酸和12種核苷類成分的方法。采用Waters XBridge Amide 色譜柱（21 mm×100 mm，35 μm），流動(dòng)相為02%甲酸水02%甲酸乙腈，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速06 mL·min-1，采用電噴霧正離子源（ESI+），多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行檢測(cè)。采用PCA主成分分析法對(duì)不同品種的蟻巢傘屬雞進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果15種氨基酸成分和12種核苷成分在一定濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0997 3，精密度，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；加樣回收率在9514%～1050%，RSD均小于50%。PCA分析顯示在氨基酸中，雞綜合評(píng)價(jià)指數(shù)分最高；在核苷中，黃雞綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最高。所建立的方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于蟻巢傘屬3種雞中15種氨基酸和12種核苷類成分的同時(shí)測(cè)定，為蟻巢傘屬雞資源內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)、全面控制以及合理開發(fā)應(yīng)用提供新的方法參考。

[關(guān)鍵詞]蟻巢傘屬； 氨基酸； 核苷； 含量測(cè)定

[Abstract]A comprehensive analytical method based on UFLCQTRAPMSMS was developed for the simultaneous determination of 15 kinds of amino acids and 12 kinds of nucleosides of three species in Termitomyces The separation was carried out on a Waters XBridge Amide column （21 mm×100 mm，35 μm） with gradient elution of mobile phase of 02% formic acid in water02% formic acid in acetonitrile at a flow rate of 06 mL·min-1， and column temperature was maintained at 30 ℃ The target compounds were analyzed by the positive ion multiple reaction monitoring （MRM） mode The principal component analysis（PCA） was made to standardized treatment for the comprehensive evaluation of different species in Termitomyces The 15 kinds of amino acids and 12 kinds of nucleosides multiple constituents showed good linearity （r>0997 3） in the range of the tested concentrationThe average recoveries ranged from 9514% to 1050%，and the relative standard deviations were less than 50% The comprehensive evaluation index obtained with PCA showed that the Termitomyces albuminosus was significantly higher than others in amino acids and in nucleosides， of which the T aurantiacus was the best The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances，which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Termitomyces fungi

[Key words]Termitomyces； amino acids； nucleosides； simultaneous determination

雞菌為擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina層菌綱Hymenomycetes傘菌目Agaricales離褶傘科Lyophyllaceae蟻巢傘屬（原稱雞菌屬）Termitomyces真菌雞菌T. albuminosus （Berk） Heim的干燥子實(shí)體，是一類生于白蟻巢上的珍貴野生食藥用菌。雞菌屬主要分布于非洲熱帶、亞洲熱帶、南太平洋島嶼和亞洲的亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主產(chǎn)于西南的云貴川，東南的福建和臺(tái)灣等地，由于該菌與某些白蟻有互惠的共生關(guān)系，故其分布范圍與大白蟻群Macrotermitinae的分布界限極為相近[17]。明代李時(shí)珍《本草綱目》[8]上就記載有“益胃，清神，治痔”的功效?，F(xiàn)代研究表明，雞菌具有抗氧化[9]、抗胃潰瘍[10]、降血脂[11]、增強(qiáng)免疫功能[12]、鎮(zhèn)痛抗炎[13]等藥理作用。其不僅含有多糖、多酚等多種生物活性成分，還含有豐富的氨基酸、核苷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)雞菌功效物質(zhì)研究主要集中于多糖、多酚等，核苷類成分尚未見報(bào)道，對(duì)于氨基酸的測(cè)定比較局限，大多需要經(jīng)過衍生化處理，然而，大部分的衍生化法都具有衍生化試劑不穩(wěn)定、操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間以及產(chǎn)生副產(chǎn)物干擾測(cè)定等缺點(diǎn)[1415]。同時(shí)核苷類成分具有重要的生理功能，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體代謝功能，增強(qiáng)抗病能力，對(duì)肝臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)有重要的作用[16]。同時(shí)，近年來越來越多的研究證實(shí)人體內(nèi)的某些氨基酸不僅作為蛋白質(zhì)合成的底物原料，是人體生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是神經(jīng)遞質(zhì)、卟啉類化合物、聚胺類化合物合成的前體[17]。此外，氨基酸可用于分辨物質(zhì)來源和保質(zhì)期[1819]。

本實(shí)驗(yàn)通過高分離度快速液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UFLCQTRAPMSMS）同時(shí)測(cè)定蟻巢傘屬3種雞中15種氨基酸和12種核苷類成分的含量，結(jié)合主成分分析（PCA）[2021]，能快速便捷了解不同品種的野生雞中氨基酸和核苷的分布，為雞資源的質(zhì)量控制與合理開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料

ABSciex QTRAP 5500三重四級(jí)桿線性離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)ABSciex公司）；LC20A快速液相儀（配有DGU20A3在線脫氣機(jī)、LC20ADXR泵、SIL20AXR自動(dòng)進(jìn)樣器及CTO20AC柱溫箱，日本Shimadzu公司）；KH500DB型數(shù)控超聲波清洗器（100 kHz，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；離心機(jī)（TGL16B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；SArtorius BT125D電子天平（1/10萬，德國(guó)賽多利斯公司）；ME36S型電子天平（1/100萬，德國(guó)賽多利斯公司）。

15種氨基酸對(duì)照品甘氨酸（glycine，批號(hào)B21915），丙氨酸（alanine，批號(hào)B21911），絲氨酸（serine，批號(hào)B21932），脯氨酸（proline，批號(hào)B21914），纈氨酸（valine，批號(hào)B21936），蘇氨酸（threonine，批號(hào)B21933），亮氨酸（leucine，批號(hào)B21925），天冬氨酸（aspartic acid，批號(hào)B21934），谷氨酸（glutamic acid，批號(hào)B21916），賴氨酸（lysine，批號(hào)B21922），甲硫氨酸（methionine，批號(hào)B21913），組氨酸（histidine，批號(hào)B21938），苯丙氨酸（phenylalanine，批號(hào)B21910），精氨酸（arginine，批號(hào)B21920），酪氨酸（tyrosine，批號(hào)B21924）。上海源葉公司，純度均大于98%。

12種核苷類對(duì)照品尿嘧啶（uracil，批號(hào)100469200401），腺嘌呤（adenine，批號(hào)110886200001），次黃嘌呤（hypoxanthine，批號(hào)B20211），鳥嘌呤（guanine，批號(hào)140631200904），2′脫氧胞苷（dideoxycytidine，批號(hào)YSJ04024），胸苷（thymidine，批號(hào)1001182663），胞苷（cytidine，批號(hào)100982718），尿苷（uridine，批號(hào)887200202），2′脫氧鳥苷（dideoxyguanosine，批號(hào)1000943454），腺苷（adenosine，批號(hào)110879200202），肌苷（inosine，批號(hào)40669201104），鳥苷（guanosine，批號(hào)1001103046）。美國(guó)Sigma公司，純度均大于98%。

水為超純水，乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司），甲酸（色譜純，德國(guó)默克公司）。

蟻巢傘屬雞類真菌編號(hào)及來源如下：S1雞采自云南楚雄彝族自治州，為雞菌T albuminosus的干燥子實(shí)體；S2灰雞采自云南白族自治州，為灰雞菌T eurrhizus （Berk） Heim的干燥子實(shí)體；S3黃雞采自四川綿陽(yáng)，為金黃雞菌T aurantiacus Heim的干燥子實(shí)體。

以上材料均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定。

以上材料分別低溫烘干并粉碎成細(xì)粉，過120目篩，放置干燥器中備用。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱Water XBridge Amide （21 mm×100 mm，35 μm）；流動(dòng)相水（含02%甲酸，A）乙腈（02%甲酸，B）；梯度洗脫0～25 min，15% A；25～5 min，15～50% A；5～7 min，50%A；7～8 min，50～15% A；8～11 min，15%A。柱溫30 ℃，流速06 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL。

22質(zhì)譜條件離子化方式電噴霧正離子（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式（MRM）測(cè)定，主要質(zhì)譜參數(shù)為氣簾氣（curtain gas）為35 psi（1 psi=6895 kPa），Gas1為55 psi，Gas2為55 psi，溫度（TEM）為550 ℃，噴霧電壓（ionspray pressure）為5 500 V，同時(shí)對(duì)檢測(cè)離子對(duì)，去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE），進(jìn)行優(yōu)化，27種目標(biāo)成分的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)列于見表1。

23對(duì)照品溶液的制備精密稱取甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤、2′脫氧胞苷、胸苷、胞苷、尿苷、2′脫氧鳥苷、腺苷、肌苷、鳥苷對(duì)照品適量，加純水配制成8016，7 4736，4 9300，6012，8048，20 3200，9880，5 9400，4 0560，4 9400，9960，7904，9940，1 5904，2004，3 9360，784，9920，7380，497，800，6060，3 0480，990，3944，4064，5880 mg·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水定容至100 mL制成混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同濃度的15種氨基酸和12種核苷類混合對(duì)照品溶液，4 ℃保存，備用。

24供試品溶液的制備精密稱取干燥恒重過80目篩的雞菌粉末1000 0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL超純水，稱重，室溫下超聲（100 kHz）提取60 min后取出，以超純水補(bǔ)足失重，提取液12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，使用時(shí)，稀釋10倍，過022 μm微孔濾膜，供UFLCQTRAPMSMS分析。

25線性關(guān)系考察及檢測(cè)限和定量限精密吸取23項(xiàng)下不同濃度系列對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 μL，在21， 22項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；按信噪S/N=3計(jì)算檢測(cè)限（LOD），以S/N=10計(jì)算定量限，見表2，圖1。

26方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：精密吸取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各對(duì)照品峰面積，15種氨基酸和12種核苷對(duì)照品的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取S2灰雞菌樣品6份，每份1000 0 g，分別按24項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣測(cè)定，15種氨基酸和12種核苷類成分的含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S2灰雞菌樣品供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，15種氨基酸和12種核苷類成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

加樣回收率試驗(yàn)： 精密稱取已知含量S2灰雞菌樣品1000 0 g，分別精密加入高、中、低3 個(gè)水平的對(duì)照品適量，每個(gè)水平3份，共9份，按24項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，并按樣品測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），

27樣品測(cè)定將供試品溶液2 μL注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，在21，22項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件測(cè)定，根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算樣品中15種氨基酸和12種核苷類成分的含量。結(jié)果見表4，圖2。

28PCA分析主成分分析（PCA）是一種降維或者把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種多元數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法。本次研究將蟻巢傘屬3種雞的15種氨基酸含量和12中核苷含量分別應(yīng)用SPSS 220分析軟件進(jìn)行主成分分析，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PCA。以特征值大于1，累積貢獻(xiàn)率大于70%為提取標(biāo)準(zhǔn)，累積貢獻(xiàn)率越大，可靠性越大。氨基酸和核苷分別得到2個(gè)主成分，見表5，其中氨基酸中前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，核苷中前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率也達(dá)到100%，均都大于70%，說明前2個(gè)因子在反映不同品種蟻巢傘屬雞的內(nèi)在質(zhì)量起著主導(dǎo)作用，能客觀反應(yīng)不同品種蟻巢傘屬雞的內(nèi)在質(zhì)量，因此選前2個(gè)主成分進(jìn)行分析。

因子載荷矩陣主要說明主成分在各變量上的載荷，載荷越高，越相關(guān)，見表6。在氨基酸中，谷氨酸、賴氨酸、組氨酸在PC1上有較高的載荷，說明PC1主要反映了谷氨酸、賴氨酸、組氨酸的信息；同理，PC2主要反映天冬氨酸、酪氨酸的信息。同理，在核苷中，PC1主要反映尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、鳥苷的信息；PC2主要反應(yīng)腺嘌呤、2′脫氧胞苷、胸苷的信息。前2個(gè)主成分基本包含了大部分成分的信息。

采用2個(gè)主成分對(duì)蟻巢傘屬3種雞進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，得出各何首烏加工品中各類成分總因子得分值F，以得分值F的大小評(píng)價(jià)各加工的優(yōu)劣。

氨基酸線性組合表達(dá)式F=F1×0584 38+F2×0415 62；核苷線性組合表達(dá)式F=F1×0

其中F為綜合得分，F(xiàn)1為第1個(gè)主成分，F(xiàn)2為第2個(gè)主成分，F(xiàn)3 為第3主成分。根據(jù)主成分的表達(dá)式可以計(jì)算出蟻巢傘屬3種雞綜合得分排序，見表7。由綜合得分可知，在氨基酸中S1，即雞得分最高，S2，即灰雞次之。在核苷中，S1，即雞得分最高，S2，即灰雞次之。

3討論

31色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2022]，大都采用甲醇、乙腈作為有機(jī)相，且氨基酸和核苷類成分大多溶于水，偏堿性，因此選取了甲醇01%磷酸水溶液、甲醇5 mmol·L-1醋酸銨（含01% 冰醋酸）、 01%的甲酸水乙腈、02%甲酸水02%甲酸乙腈。結(jié)果表明，乙腈分離效果比甲醇好，且在水和乙腈中同時(shí)加入02%的甲酸可改善峰形，減少色譜峰拖尾，峰形較好，分離度高。因此本實(shí)驗(yàn)采用02%甲酸水02%甲酸乙腈為流動(dòng)相。

32供試品制備方法的優(yōu)化查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2325]，實(shí)驗(yàn)中對(duì)提取溶劑（水、70%甲醇）、液料比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40）、提取方法（回流、超聲）及提取時(shí)間（20，40，60，80 min）進(jìn)行了單因素考察。結(jié)果表明，以水為提取溶劑，液料比為1∶20，超聲提取60 min，能提出更多的待測(cè)物。因此選擇以水為溶劑，液料比1∶20，超聲提取60 min。

33結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，由圖2可知，蟻巢傘屬3種雞中氨基酸總含量差異較大，且S1>S2>S3；核苷總含量差異較氨基酸來說較小，

不過含量同樣是S1>S2>S3。由表4可知，各品種中氨基酸和核苷類成分含量差異較大，蟻巢傘屬3種雞中氨基酸類成分中，以丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸為主要成分，其中纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸為人體內(nèi)必需氨基酸。同理，在核苷類成分中，尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥嘌呤、尿苷、鳥苷為主要成分。

結(jié)合PCA主成分分析綜合評(píng)價(jià)，可知，在氨基酸中S1，即雞得分最高，S2，即灰雞次之，因此，若以氨基酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，則S1質(zhì)量最為好。同理，在核苷中，S1，即雞得分最高，S2，即灰雞次之，則以核苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，S1質(zhì)量最好。

本實(shí)驗(yàn)建立了UFLCQTRAPMSMS同時(shí)測(cè)定蟻巢傘屬3種雞中15種氨基酸和12種核苷的含量，比較了不同品種雞中含量的差異，并通過PCA主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步探索評(píng)價(jià)蟻巢傘屬雞中內(nèi)在質(zhì)量及控制提供依據(jù)，同時(shí)為擴(kuò)大藥用菌物資源提供借鑒。

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