基于QbD理念的安宮牛黃丸整體混合終點(diǎn)評(píng)價(jià)方法研究

劉曉娜+鄭秋生+車曉青+吳志生+喬延江

[摘要]大品種中藥安宮牛黃丸混合終點(diǎn)判斷是關(guān)鍵的技術(shù)問題。基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念的控制策略，研究提出一種整體混合終點(diǎn)的判斷方法，為含礦物質(zhì)中藥混合提供方法學(xué)。采用激光誘導(dǎo)擊穿光譜（LIBS）技術(shù)獲得安宮牛黃丸混合中間體的光譜數(shù)據(jù)。結(jié)合移動(dòng)窗相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差法（MWRSD）法，朱砂、雄黃和珍珠粉為整合研究指標(biāo)，通過比較相鄰混合時(shí)間光譜的差異，快速評(píng)價(jià)整體混合過程。雄黃、朱砂和珍珠粉3個(gè)藥味的混合過程并非完全一致，但在混合的最后一個(gè)階段，3個(gè)藥味均達(dá)到了混合均勻；得到建議混合終點(diǎn)。采用LIBS過程技術(shù)建立的微區(qū)時(shí)序分析方法，實(shí)施過程控制。所建立的方法無需標(biāo)準(zhǔn)光譜庫(kù)，具有分析快速、近似無損、無需復(fù)雜的樣品前處理的等特點(diǎn)，為大品種中藥制劑的質(zhì)量研究提供新思路。

[關(guān)鍵詞]安宮牛黃丸； 混合終點(diǎn)； 激光誘導(dǎo)擊穿光譜； 質(zhì)量源于設(shè)計(jì)； 過程分析技術(shù)

[Abstract]The blending endpoint determination of Angong Niuhuang Wan （AGNH） is a key technology problem The control strategy based on quality by design （QbD） concept proposes a whole blending endpoint determination method， and provides a methodology for blending the Chinese materia medica containing mineral substances Based on QbD concept， the laser induced breakdown spectroscopy （LIBS） was used to assess the cinnabar， realgar and pearl powder blending of AGNH in a pilotscale experiment， especially the whole blending endpoint in this study The blending variability of three mineral medicines including cinnabar， realgar and pearl powder， was measured by moving window relative standard deviation （MWRSD） based on LIBS The time profiles of realgar and pearl powder did not produce consistent results completely， but all of them reached even blending at the last blending stage， so that the whole proposal blending end point was determined LIBS is a promising Process Analytical Technology （PAT） for process control Unlike other elemental determination technologies such ICPOES， LIBS does not need an elaborate digestion procedure， which is a promising and rapid technique to understand the blending process of Chinese materia medica （CMM） containing cinnabar， realgar and other mineral traditional Chinese medicine This study proposed a novel method for the research of large varieties of traditional Chinese medicines

[Key words]Angong Niuhuang Wan； whole blending endpoint； laserinduced breakdown spectroscopy； quality by design； process analytical technology

安宮牛黃丸是中醫(yī)治療高熱癥的“溫病三寶”之一[1]，歷來是中醫(yī)用于治療各類急證的必備要藥。安宮牛黃丸處方的組分比較復(fù)雜，其中雄黃、朱砂比例均為10%，藥味的比重差異較大，從而影響藥效和安全性。粉末混合過程為動(dòng)態(tài)變化的時(shí)間序列，其主要目的是確定混合終點(diǎn)，指導(dǎo)混合工藝優(yōu)化[23]。大品種中藥安宮牛黃丸混合終點(diǎn)判斷是關(guān)鍵的技術(shù)問題。馬群[4]應(yīng)用近紅外在線分析技術(shù)檢測(cè)安宮牛黃丸原粉混合終點(diǎn)，運(yùn)用相似度匹配法判斷混合終點(diǎn)；劉珊珊等[5]采用近紅外光譜結(jié)合移動(dòng)窗標(biāo)準(zhǔn)偏差法對(duì)安宮牛黃丸的中試混合過程進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)；并采用高效液相色譜法驗(yàn)證中間體中有效成分黃芩苷等成分的變化，驗(yàn)證了近紅外在線分析技術(shù)指導(dǎo)混合終點(diǎn)判斷的可靠性。目前尚未有針對(duì)礦物質(zhì)中藥的混合過程的研究，缺乏質(zhì)量控制的有效方法，難以保證含礦物質(zhì)中成藥質(zhì)量的穩(wěn)定、均一。21世紀(jì)初，美國(guó)推出了Quality by Design“QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）”理念。QbD 是一種系統(tǒng)的研究方法，強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品和工藝的理解，以及對(duì)工藝過程的控制[67]。在制藥行業(yè)，QbD的初始設(shè)計(jì)決定產(chǎn)品質(zhì)量的理念已逐漸被業(yè)界認(rèn)可?！百|(zhì)量可控、安全有效”是藥品研發(fā)過程須遵循的首要原則。其中，質(zhì)量可控又是安全有效的前提條件。激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)（laserinduced breakdown spectroscopy，LIBS）是新興的微區(qū)多元素檢測(cè)技術(shù)，是以激光脈沖作為激發(fā)源誘導(dǎo)產(chǎn)生激光等離子體的原子發(fā)射光譜[810]。在解決多指標(biāo)、多成分的中藥分析時(shí)，LIBS區(qū)別于傳統(tǒng)的元素分析技術(shù)，具有諸多的優(yōu)勢(shì)：快速、綠色、多元素檢測(cè)及近似無損的特點(diǎn)[11]。本研究基于QbD理念，采用LIBS過程分析技術(shù)評(píng)價(jià)安宮牛黃丸的整體混合過程，以朱砂、雄黃和珍珠粉3個(gè)藥味為研究載體，通過LIBS技術(shù)在若干時(shí)間點(diǎn)代表性的采樣獲得混合過程的微區(qū)光譜。以特定元素砷（As）、汞（Hg）、鈣（Ca）分析結(jié)果為斷面，快速評(píng)價(jià)安宮牛黃丸的混合過程的微區(qū)時(shí)序特征，了解含礦物質(zhì)中藥粉末混合過程的規(guī)律，建立合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，指導(dǎo)整合終點(diǎn)判斷；確保含礦物質(zhì)中藥混合的均一性，為保證生產(chǎn)過程的工藝可控性提供了基礎(chǔ)。

1材料

黃芩、黃連、梔子、郁金、牛黃、水牛角濃縮粉、朱砂、雄黃、冰片和珍珠粉等藥材均由北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所提供。安宮牛黃丸混合中間體由北京中醫(yī)藥大學(xué)馬群教授提供。模擬安宮牛黃丸的混合過程，并得到44個(gè)安宮牛黃丸混合中間體樣品（0，15，2，3，4，5 min，每隔1 min取樣至43 min）。

激光誘導(dǎo)擊穿光譜采用LIBS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院，國(guó)家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心友情提供；系統(tǒng)由激光器、光譜儀、三維精密運(yùn)動(dòng)平臺(tái)、CCD探測(cè)器、信號(hào)延時(shí)器組成。光譜儀采用海洋光學(xué)公司（Ocean Optics）的HR 2000+，波長(zhǎng)范圍198～876 nm。FW4/A紅外壓片機(jī)，天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司。

2方法

21安宮牛黃丸混合中間體的LIBS 光譜采集

為防止激光擊打時(shí)的粉末飛濺現(xiàn)象，分別取安宮牛黃丸混合中間體適量，采用紅外壓片機(jī)壓制呈直徑13 mm、厚度約1 mm的錠片，共制備44個(gè)錠片樣品。光譜采集方式見圖1，計(jì)算6個(gè)采樣位點(diǎn)的平均光譜，即得到混合過程的微區(qū)時(shí)序光譜。

22LIBS差譜法

珍珠的主要成分有碳酸鈣。由于鈣信號(hào)同時(shí)來自其他藥味，故采用差譜法歸屬珍珠粉中Ca特征譜線。

23安宮牛黃丸混合終點(diǎn)判斷方法

采用移動(dòng)窗標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差（moving window relative standard deviation，MWRSD）[1213]進(jìn)行中間體整合終點(diǎn)判斷。MWRSD選擇混合中間體的n張連續(xù)的光譜，計(jì)算n張連續(xù)光譜中待測(cè)元素的特征譜線強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），剔除原n 條光譜中時(shí)間最早的光譜，補(bǔ)充一條新光譜，重新計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此類推計(jì)算所有時(shí)序光譜數(shù)據(jù)，計(jì)算公式如下。

Ai，Aij分別為i，ij時(shí)混合中間體的LIBS光譜中砷元素或汞元素的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。此處選擇移動(dòng)窗口n=3；每次增加1個(gè)樣品，連續(xù)移動(dòng)。最終得到混合過程中不同取樣點(diǎn)中間體樣品光譜的標(biāo)準(zhǔn)偏差。以RSD為縱坐標(biāo)，混合時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。RSD越小，表明元素的特征譜線信號(hào)強(qiáng)度變化小，混合越均勻，提示混合終點(diǎn)。

劉曉娜等：基于QbD理念的安宮牛黃丸整體混合終點(diǎn)評(píng)價(jià)方法研究24數(shù)據(jù)處理和軟件

采用OOILIBS （Ocean Optics） 軟件讀取光譜數(shù)據(jù)；采用ORIGIN 8軟件畫圖。

3結(jié)果

31安宮牛黃丸混合中間體的LIBS光譜

混合過程中15 min混合中間體的LIBS 光譜見圖2?；旌现虚g體的特征譜線除了Ca，鉀（K），鈉（Na），鎂（Mg），鋰（Li），碳（C），氫（H），氧（O），氮（N），等；同時(shí)出現(xiàn)As（228816，234984，616979 nm）和Hg（253651，296732，313123 nm）。譜中590～610 nm處受到基質(zhì)效應(yīng)影響，但并未影響As，Hg的特征譜線。225～260 nm的局部放大圖見圖3，As 228816 nm，Hg 253651 nm處特征譜線未受到其他元素的干擾[1415]。因此，選擇此處特征譜線，研究安宮牛黃丸混合過程中礦物藥雄黃、朱砂的變化規(guī)律。

32Ca的LIBS差譜

Ca的特征譜線有315839，370627，373668，393379，396829，422640，430228，487704，534970，558842，585802，612715，616231，643965，646284，649403，714852，720267，732426，849760，849760，854172 nm [1618]。Ca同時(shí)來自于植物藥材和珍珠粉，故將30 min 混合中間體LIBS 譜與0 min 譜做差譜，然后比對(duì)0 min 樣本與差譜之間的光譜差異，見圖4，最終選定特征譜線393379，585746，643965，854172 nm為珍珠粉中Ca的光譜信號(hào)。

33安宮牛黃丸整體混合終點(diǎn)判斷

331朱砂和雄黃混合終點(diǎn)判斷采用MWRSD法對(duì)LIBS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，設(shè)定10%為閾值。將混合過程進(jìn)行劃分時(shí)段，As和Hg在不同的特征譜線處的MWRSD變化趨勢(shì)圖見圖5。圖5 （a） 劃分4個(gè)階段，在混合的前20 min，Hg 53651 nm處的MWRSD變化劇烈；隨著混合的進(jìn)行，B段（20～27 min）MWRSD相對(duì)較平穩(wěn)，且MWRSD小于10%；進(jìn)一步混合，C段（27～37 min）中MWRSD出現(xiàn)較大幅度波動(dòng)；D段（37～43 min）MWRSD呈相對(duì)平穩(wěn)階段且MWRSD小于10%，提示到達(dá)混合終點(diǎn)到達(dá)。與Hg相似，As 228816 nm的混合可以劃分了4個(gè)階段，見圖5 （b）。A段（0～27 min）和C段（32～38 min）過程中MWRSD變化劇烈；B段（21～28 min）和D段（38～43 min）過程中MWRSD保持相對(duì)平穩(wěn)，且MWRSD小于10%。雖然As和Hg在B段均出現(xiàn)相對(duì)平穩(wěn)顯現(xiàn)，但混合并不完全，并非混合終點(diǎn)。綜合考慮，As和Hg的混合終點(diǎn)D段，建議混合終點(diǎn)為38 min。

332珍珠粉的混合終點(diǎn)判斷珍珠粉是安宮牛黃丸的組成成分之一，其主要成分是碳酸鈣。珍珠粉的混合是否與朱砂、雄黃的混合過程一致，混合終點(diǎn)是否一致？研究探討安宮牛黃丸混合過程中，珍珠粉的混合過程變化特點(diǎn)和規(guī)律?；旌线^程中Ca在不同的特征譜線處的MWRSD變化趨勢(shì)圖見圖6。圖6 （a） 劃分了4個(gè)階段，在混合的前20 min，Ca 393379 nm處的MWRSD變化劇烈；隨著混合的進(jìn)行，B段（20～29 min）MWRSD相對(duì)平穩(wěn)，MWRSD小于10%；進(jìn)一步混合，C段（29～38 min）中MWRSD出現(xiàn)波動(dòng)；D段（38～43 min）MWRSD呈相對(duì)平穩(wěn)階段且MWRSD小于10%，提示到達(dá)混合終點(diǎn)。圖6 （b） 顯示2個(gè)混合階段，A段 在混合開始的前13 min，Ca 585746 nm處的MWRSD變化劇烈，提示激烈混合的過程；B段在混合13～43 min過程中MWRSD相對(duì)平穩(wěn)，且均小于10%，表明在此階段混合較平穩(wěn)。圖6（c）中Ca 643965 nm處的MWRSD變化趨勢(shì)圖與圖6 （a） Ca 393379 nm處的MWRSD變化趨勢(shì)圖相似，混合分為4個(gè)階段；A段（0～21 min）和C段（27～38 min）過程中MWRSD變化劇烈；B段（21～28 min）和D段（38～43 min）過程中MWRSD保持相對(duì)平穩(wěn)，而且MWRSD小于10%。與圖6 （a）、圖6（c）相似，圖6（d）中Ca 854172 nm處的MWRSD變化同樣呈現(xiàn)4個(gè)階段，在混合開始的13 min，MWRSD變化劇烈，隨著混合的進(jìn)行，B段（13～27 min）內(nèi)MWRSD變化平穩(wěn)，進(jìn)一步混合，在混合的27～38 min 時(shí)MWRSD出現(xiàn)微小波動(dòng)，在38 min 后（D段）MWRSD相對(duì)平穩(wěn)且小于10%。Ca在4個(gè)特征譜線處處特征譜線的建議混合終點(diǎn)為38 min。

3333個(gè)藥味整體的混合終點(diǎn)判斷LIBS技術(shù)結(jié)合MWRSD的朱砂、雄黃和珍珠粉在B段和D段的微區(qū)時(shí)序混合分析結(jié)果見圖 7。對(duì)比發(fā)現(xiàn)在B段 Hg與Ca共同時(shí)間段為21～27 min；但是As即雄黃在B段混合相對(duì)均勻時(shí)間段為27～31 min；表明在B段雄黃與朱砂和珍珠粉的混合并非同步。在D段（Ca 585746 nm為D段），其他元素共同時(shí)間段為38～43 min，表明3個(gè)藥味同時(shí)達(dá)到了混合均勻；故朱砂、雄黃和珍珠粉的共同混合終點(diǎn)為38 min。

4討論

QbD理念正推動(dòng)著藥品生產(chǎn)模式從傳統(tǒng)的以檢驗(yàn)為主到以科學(xué)地研究生產(chǎn)過程為主。ICH發(fā)布

的Q8（pharmaceutical development，Q8）藥物研發(fā)中指出，質(zhì)量是通過設(shè)計(jì)賦予的。獲得合格的質(zhì)量，必須加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品的理解和對(duì)成產(chǎn)的全過程控制。ICH Q8的控制策略為“源于對(duì)現(xiàn)行產(chǎn)品和工藝的理解，制定一系列有計(jì)劃的控制，用于確保工藝性能與產(chǎn)品質(zhì)量的[6]。所有產(chǎn)品的質(zhì)量屬性和工藝參數(shù)，均屬于ICH Q8控制策略范疇。QbD理念，要求生產(chǎn)過程中對(duì)工藝過程進(jìn)行“實(shí)時(shí)質(zhì)量保證”，保證每個(gè)步驟工藝的輸出均符合質(zhì)量要求。關(guān)鍵工藝參數(shù)合格即可保證產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到要求。

粉末混合過程是中藥固體制劑生產(chǎn)的重要操作單元之一，也是時(shí)序過程。藥物混合均勻度直接影響藥品的療效。藥物混合均勻度直接影響藥品的療效。安宮牛黃丸是一種完全以藥材原粉入藥的中藥丸劑，其處方的組分比較復(fù)雜，植物性藥材、動(dòng)物性藥材和礦物性藥材同時(shí)出現(xiàn)在處方中，導(dǎo)致藥味的比重差異較大，尤其是含重金屬礦物質(zhì)如朱砂、雄黃等中藥制劑的混合均勻與否不僅影響其療效，而且嚴(yán)重影響其用藥安全。對(duì)于中藥的混合過程的評(píng)價(jià)多采用離線液相色譜法、氣相色譜法等對(duì)其判斷。這些方法雖然準(zhǔn)確度高，但樣品處理復(fù)雜，且多以研究有機(jī)化合物為主，未考慮礦物質(zhì)中藥的混合特征。

本文基于QbD控制策略，將LIBS過程技術(shù)應(yīng)用于安宮牛黃丸的整體混合過程，結(jié)合MWRSD法研究雄黃、朱砂和珍珠粉3個(gè)藥味的微區(qū)時(shí)序特征。構(gòu)建的金屬元素快速檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)整體混合終點(diǎn)的快速判斷，確保混合均勻。結(jié)果表明：在混合的整個(gè)時(shí)序過程中，初始階段物料混合相對(duì)劇烈，混合效率高，到達(dá)最佳的混合狀態(tài)后反方向變換，出現(xiàn)偏析或分料現(xiàn)象；隨著進(jìn)一步混合，顆粒以擴(kuò)散混合為主。在整個(gè)混合過程中物料的混合和分離同時(shí)發(fā)生，當(dāng)二者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)即混合終點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)物料混合均勻的時(shí)間不是一個(gè)固定的時(shí)間點(diǎn)，而且是一個(gè)時(shí)間段，超過此時(shí)間段，粉末會(huì)出現(xiàn)過混合現(xiàn)象。雄黃、朱砂和珍珠粉的混合過程并非完全一致，但在混合的最后一個(gè)階段，3個(gè)藥味均達(dá)到了混合均勻；得到建議混合終點(diǎn)，且無過混合現(xiàn)象發(fā)生。所建立的方法無需建立標(biāo)準(zhǔn)光譜庫(kù)，通過比較時(shí)間序列中相鄰混合時(shí)間的光譜差異，實(shí)現(xiàn)了朱砂、雄黃和珍珠粉混合終點(diǎn)的快速判斷。

過程分析技術(shù)（PAT）屬于第三級(jí)控制策略，其目的在于增加過程理解、提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，其優(yōu)勢(shì)在于實(shí)時(shí)分析、監(jiān)測(cè)、控制。LIBS技術(shù)屬于PAT技術(shù)，在微區(qū)時(shí)序分析研究方面彰顯了其快速、實(shí)時(shí)、近似無損等優(yōu)勢(shì)，有望用于中藥混合過程的回饋控制，有效避免過度混合和資源浪費(fèi)。將PAT技術(shù)應(yīng)用于中藥材粉末的混合過程，研究混合過程時(shí)序變化的特點(diǎn)和規(guī)律，對(duì)過程理解具有重要的意義，同時(shí)為含礦物質(zhì)中藥制劑混合的在線監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。

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