肥大性下橄欖核變性分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

馮佳梁, 周 慧, 沈佐廷, 李 飛, 張社卿

(1. 上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 上海, 200433;2. 上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 上海, 200433)

綜 述

肥大性下橄欖核變性分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

馮佳梁1,2, 周 慧2, 沈佐廷2, 李 飛2, 張社卿1

(1. 上海市第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 上海, 200433;2. 上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 上海, 200433)

肥大性下橄欖核變性; 基因診斷; POLG基因; SURF1基因; SCA1型基因; 研究進(jìn)展

肥大性下橄欖核變性(HOD)是一種臨床少見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床特點(diǎn)為在原發(fā)病變穩(wěn)定后出現(xiàn)頭暈、視物不清、眼震、腭肌陣攣、肢體震顫、共濟(jì)失調(diào)等表現(xiàn)，其中上腭震顫為其典型癥狀，通常在格莫三角損傷后數(shù)周至數(shù)月出現(xiàn)，約5～24周癥狀達(dá)到高峰。原發(fā)腦損傷疾病已經(jīng)給患者帶來(lái)很多痛苦[1], 而HOD這一繼發(fā)病癥的出現(xiàn)又再次加重了軀體損傷，增加了患者精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，如何早期診斷并有效干預(yù)成為臨床研究熱點(diǎn)。研究[2-4]表明，線粒體缺陷與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如帕金森綜合征、Alpers綜合征、進(jìn)行性眼外肌麻痹等，而HOD屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種，有國(guó)外學(xué)者研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，外顯子測(cè)序鑒定提示純合子致病P-W748 POLG突變，SURF1基因突變與其發(fā)生也密切相關(guān)，因此，從基因角度對(duì)HOD發(fā)病時(shí)基因的反應(yīng)模式進(jìn)行診斷可以避免影像學(xué)檢查的滯后性，有助于為其早期診斷提供更多的幫助。本文對(duì)基因診斷HOD的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為其早期診斷、及早干預(yù)提供依據(jù)。

1 肥大性下橄欖核變性候選基因

1.1 POLG基因

線粒體是普遍存在于真核細(xì)胞的半自主性細(xì)胞器，是氧化磷酸化的場(chǎng)所，線粒體的生物活動(dòng)依賴(lài)于線粒體DNA編碼的蛋白的表達(dá)，線粒體DNA 是由16 569個(gè)堿基對(duì)組成的雙鏈裸露的超螺旋閉合共價(jià)環(huán)狀DNA分子, DNA聚合酶γ(pol γ)多肽位于線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，由1 239個(gè)氨基酸組成的雜合二聚體，分子長(zhǎng)度為139.5 KDa, 包括140 kDa的催化亞基及55 kDa的調(diào)節(jié)亞基，具有促進(jìn)pol γ與DNA雙鏈的緊密結(jié)合啟動(dòng)DNA復(fù)制的功能，其是線粒體中唯一起聚合酶作用的酶，在線粒體DNA的復(fù)制及修復(fù)中發(fā)揮重要作用[7-8]。催化亞基是由線粒體 DNA 特異性聚合酶 G(POLG)基因編碼, POLG基因位于15號(hào)染色體，包含10個(gè)連串的編碼谷氨酰胺的CAG密碼子的CAG-三核苷酸重復(fù)多態(tài)性參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，當(dāng)POLG基因發(fā)生CAG-三核苷酸重復(fù)長(zhǎng)度的突變后，線粒體DNA比率超過(guò)閾值，會(huì)使得DNA聚合酶γ的校正功能喪失，造成線粒體DNA的點(diǎn)突變、缺失和多發(fā)缺失以及含量的減少，線粒體不能提供足夠的能量，細(xì)胞正常的氧化磷酸化功能受到阻礙，促進(jìn)反應(yīng)性產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致易感性神經(jīng)變性疾病[9-10]。目前, POLG基因突變導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)、少年型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、癲癇綜合征、進(jìn)行性眼外肌麻痹、阿爾茨海默病等，而肥大性下橄欖核變性屬于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種，病變主要累及小腦、腦干，出現(xiàn)神經(jīng)元變性，臨床表現(xiàn)出現(xiàn)震顫、共濟(jì)失調(diào)等，與感覺(jué)性共濟(jì)失調(diào)、少年型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)等相似。有國(guó)外學(xué)者研究[11]發(fā)現(xiàn)，干擾素治療丙肝后出現(xiàn)耳聾、嗜睡，口齒不清，步態(tài)不穩(wěn)，查體水平眼震，共濟(jì)失調(diào)步態(tài)，末梢感覺(jué)消失，無(wú)腭肌陣攣, MRI提示雙側(cè)肥大性下橄欖核變性，外顯子測(cè)序鑒定提示純合子致病P-W748 POLG突變。基因突變分為純合子及雜合子突變，而POLG基因的16號(hào)外顯子上存在2492位點(diǎn)A→G的雜合突變與肥大性下橄欖核變性發(fā)生相關(guān)。

1.2 SURF1基因

線粒體DNA 包含編碼氧化磷酸化呼吸鏈復(fù)合體必需的13個(gè)多肽，線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白由核基因和線粒體基因共同編碼，呼吸鏈氧化磷酸化亞基基因共有 92 個(gè)，線粒體基因僅編碼其中的13 種，剩余79個(gè)均由核基因編碼[12]。線粒體呼吸鏈由5種酶復(fù)合物組成，呼吸鏈復(fù)合物IV即細(xì)胞色素C氧化酶，存在于真核生物細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜上，由13個(gè)多肽亞單位組成，其中3個(gè)由線粒體基因編碼，其余均由核基因編碼，在細(xì)胞呼吸中處于細(xì)胞色素系統(tǒng)的末端，通過(guò)氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量[13-14]。當(dāng)編碼氧化磷酸化系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的核基因發(fā)生致病性突變時(shí)，導(dǎo)致相關(guān)呼吸鏈酶功能喪失或降低，引起線粒體組裝或功能障礙，線粒體蛋白合成障礙和呼吸鏈組分和功能異常，使能量消耗很大的神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)功能障礙和組織壞死[15-16]。呼吸鏈復(fù)合物亞基及組裝因子突變屬于核基因突變的一種，人SURF1蛋白的第25～299位氨基酸構(gòu)成的肽鏈形成SURF1家族，含有300個(gè)氨基酸殘基，有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合物的組裝以及維持其正?；钚?，人類(lèi)SURF1基因包含9個(gè)外顯子，位于9q34.2, 基因組序列全長(zhǎng)4695 bp, 具有進(jìn)化上的保守性，從原核到真核生物都發(fā)現(xiàn)有SURF1基因的同源序列。人類(lèi)SURF1基因異常，如604G→C突變導(dǎo)致的SURF1蛋白第202位氨基酸殘基由酸性天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性組氨酸，或者574C→G的顛換為雜合性的錯(cuò)義突變導(dǎo)致的第192位氨基酸由堿性的精氨酸變?yōu)橹行缘母拾彼幔瑫?huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C氧化酶功能缺陷，細(xì)胞色素C氧化酶功能缺陷影響ATP生成，均可直接或者間接對(duì)神經(jīng)通路造成影響，累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是腦，出現(xiàn)視力障礙、構(gòu)音障礙、吞咽困難、上肢共濟(jì)失調(diào)、站立及行走困難等癥狀[17-18]。

1.3 SCA1型基因

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(SCA)基因共定位28種致病基因, 7種為基因編碼區(qū)CAG-三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增突變，導(dǎo)致編碼產(chǎn)生的多聚谷氨酰胺異常集聚，導(dǎo)致表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)、言語(yǔ)不清、構(gòu)音障礙、眼球震顫等癥狀的橄欖腦橋小腦萎縮的發(fā)生，由于橄欖腦橋小腦萎縮與肥大性下橄欖核變性的病變均主要累及小腦、腦干，出現(xiàn)神經(jīng)元變性，臨床表現(xiàn)也頗為相似，因此部分學(xué)者[19-20]認(rèn)為橄欖腦橋小腦萎縮與肥大性下橄欖核變性的發(fā)病機(jī)制存在一定的共性。SCA1位于染色體6q22～23, 基因組跨度450 kb, cDNA長(zhǎng)11kb, 含有9個(gè)外顯子，編碼816個(gè)氨基酸殘基組成ataxia-1蛋白，該蛋白位于細(xì)胞核，橄欖腦橋小腦萎縮患者第8號(hào)外顯子發(fā)生CAG突變后其重復(fù)擴(kuò)增的拷貝數(shù)為40～83, 正常人為6～38[21-22]。SCA2 型基因定位在染色體12q23～q24.1上，正常等位基因含有 17～29 個(gè) CAG-三核苷酸重復(fù)和1～3 個(gè) CAA 重復(fù)，橄欖腦橋小腦萎縮患者5′端外顯子 1 編碼區(qū)發(fā)生CAG突變后其重復(fù)擴(kuò)增的拷貝數(shù)為37～63。CA3型基因定位在染色體14q32.1, 正常人 CAG 重復(fù) 13～36 次，橄欖腦橋小腦萎縮患者重復(fù) 68～79次。

2 肥大性下橄欖核變性基因診斷相關(guān)技術(shù)

隨著分子遺傳學(xué)及基因?qū)W的發(fā)展，基因診斷因其特異性強(qiáng)、可操作性強(qiáng)，已成為臨床科研的熱點(diǎn)，目前，根據(jù)是否對(duì)致病基因本身進(jìn)行檢查分為兩類(lèi)，一類(lèi)是采用利用 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物或者鄰近的 DNA 序列作為探針的直接基因診斷，另一類(lèi)是遺傳連鎖分析的間接基因診斷[23]。肥大性下橄欖核變性常繼發(fā)于腦梗死、中毒、手術(shù)及外傷、腫瘤、血管畸形、腦出血等導(dǎo)致的格莫三角損傷的腦部疾病，是由于神經(jīng)傳導(dǎo)在這個(gè)三角通路中阻斷，所發(fā)生的一種獨(dú)特的跨突觸神經(jīng)變性，導(dǎo)致傳入細(xì)胞的突觸丟失，這種特異性的變性在原發(fā)病變后一段時(shí)期發(fā)生順行性空泡變性，導(dǎo)致受影響的下橄欖核部位的神經(jīng)元體積增大，隨著時(shí)間的推移，肥大逐漸減輕，隨后又出現(xiàn)細(xì)胞萎縮，因此，臨床上將其歸于線粒體障礙性疾病，多采用直接基因診斷對(duì)治病基因進(jìn)行檢測(cè)[24]。首先采用PCR-RFLP技術(shù)，取正常人群作為對(duì)照，選擇基因引物，如POLG基因正向引物為5′-ACAGTGTTGGGGACGCAG-3′, 反向引物為5′-CCTCGCCAGGCATCTCC-3′; SURF1基因引物: 正向引物為5′-TGGCTCCATGTCAGTGTTGT-3′, 反向引物為5′-AGGGCTCTGCTGTTGAACTC-3′擴(kuò)增所有研究對(duì)象候選基因全部外顯子后, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HinfⅠ酶切獲得不同長(zhǎng)度、大小、數(shù)量的限制性酶切片段，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并采用末端終止法進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)單堿基替代以及小片段核苷酸的插入或缺失，迅速而準(zhǔn)確的解讀基因突變信息[25]。

3 展 望

1887年Oppenheim首次報(bào)道肥大性下橄欖核變性，通過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)了下橄欖核增大的特征性病理改變。1931年, Guillain和Mollaret描述了小腦齒狀核與對(duì)側(cè)的紅核和下橄欖核構(gòu)成的等邊三角傳導(dǎo)通路，也稱(chēng)之為格莫三角，正如Guillain和Mollaret所描述的，在格莫三角中的神經(jīng)元聯(lián)系著對(duì)側(cè)小腦的齒狀核、同側(cè)中腦的紅核、同側(cè)延髓的下橄欖核，由齒狀核發(fā)出的神經(jīng)纖維通過(guò)小腦上腳傳入對(duì)側(cè)的紅核，途中與小腦臂發(fā)生交互作用，紅核發(fā)出的神經(jīng)纖維通過(guò)中央被蓋束傳入下橄欖核。下橄欖核發(fā)出神經(jīng)纖維通過(guò)小腦下腳聯(lián)系對(duì)側(cè)的齒狀核，當(dāng)損傷位于紅核或中央被蓋束時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致同側(cè)的橄欖核肥大變性，當(dāng)損傷位于小腦上腳或齒狀核時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致對(duì)側(cè)的橄欖核肥大變性，如果同時(shí)損傷到紅核或中央被蓋束以及齒狀核及小腦上腳時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致雙側(cè)的肥大性下橄欖核變性。

肥大性下橄欖核變性臨床特點(diǎn)為在原發(fā)病變穩(wěn)定后出現(xiàn)頭暈、視物不清、眼震、腭肌陣攣、肢體震顫、共濟(jì)失調(diào)等表現(xiàn)，典型癥狀為上腭震顫，其為軟腭有節(jié)奏的連續(xù)的運(yùn)動(dòng)，有時(shí)累及其他顱神經(jīng)或脊神經(jīng)支配的肌肉，但是肥大性下橄欖核變性臨床表現(xiàn)與遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、橄欖腦橋小腦萎縮等神經(jīng)系統(tǒng)疾病表現(xiàn)相似，無(wú)法根據(jù)臨床癥狀對(duì)其進(jìn)行診斷。影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肥大性下橄欖核變性患者在MRI上有非常特征的影像學(xué)表現(xiàn)，在原發(fā)病損傷1月后, MRI在T2WI上通常會(huì)出現(xiàn)下橄欖核高信號(hào)征，并持續(xù)數(shù)年，原發(fā)損傷約半年后出現(xiàn)下橄欖核肥大，并持續(xù)3～4年，隨后出現(xiàn)萎縮，在下橄欖核肥大階段, MRI上表現(xiàn)為延髓腹外側(cè)局限性T2WI長(zhǎng)信號(hào)結(jié)節(jié)灶，輪廓呈蛋形，稱(chēng)之為蛋形征，是診斷此病的重要依據(jù)[26-28], 但是影像學(xué)檢查具有滯后性，不適合用于對(duì)其進(jìn)行早期診斷。當(dāng)前的研究[29]發(fā)現(xiàn), POLG基因的突變將會(huì)影響DNA聚合酶γ的復(fù)制, Surfeit人1蛋白(SURF1)基因突變導(dǎo)致細(xì)胞色素C氧化酶缺陷，候選基因的突變均會(huì)造成線粒體能量生成障礙，使神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性會(huì)明顯增加，因此，在腦梗死、中毒、手術(shù)及外傷、腫瘤、血管畸形、腦出血等腦損傷發(fā)生后對(duì)患者基因進(jìn)行檢測(cè)，有助于預(yù)測(cè)肥大性下橄欖核變性是否發(fā)生，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行早期診斷。但是，基因診斷應(yīng)用于肥大性下橄欖核變性仍具有以下不足: ①基因診斷應(yīng)用于肥大性下橄欖核變性容易受醫(yī)務(wù)工作人員素質(zhì)、社會(huì)支持度等多種因素影響。②由于國(guó)內(nèi)外的基因診斷應(yīng)用于肥大性下橄欖核變性的研究報(bào)道仍較少，導(dǎo)致候選基因種類(lèi)較少。

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2017-01-20

張社卿

R 714.14

A

1672-2353(2017)15-227-03

10.7619/jcmp.201715082