小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞WTX基因穩(wěn)定干擾系的建立

王蕾，張慶玲

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515;2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院·廣東省分子腫瘤病理學(xué)重點實驗室)

小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞WTX基因穩(wěn)定干擾系的建立

王蕾1,2，張慶玲1,2

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515;2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院·廣東省分子腫瘤病理學(xué)重點實驗室)

目的 應(yīng)用WTX基因重組慢病毒干擾載體，感染小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞，建立WTX穩(wěn)定干擾小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞系。方法 慢病毒感染小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞，熒光顯微鏡初步觀察感染效率，G418進一步篩選得到穩(wěn)定感染細(xì)胞系。qPCR及Western blotting、免疫組織化學(xué)檢測WTX mRNA及蛋白干擾效率。結(jié)果 慢病毒感染小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞后，WTX基因mRNA及蛋白表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，CT26結(jié)直腸癌細(xì)胞WTX干擾穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。結(jié)論 用慢病毒感染方法成功建立了小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞WTX穩(wěn)定干擾細(xì)胞系。

結(jié)直腸癌；WTX基因；慢病毒載體； 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

WTX基因(又稱作FAM123B、AMER1、OSCS)，是Rivera等在腎母細(xì)胞瘤(Wilms瘤)的研究中發(fā)現(xiàn)的首個位于X染色體上的抑癌基因WTX基因[1]。不同于常染色體顯性遺傳的腫瘤抑制基因，WTX經(jīng)由單次打擊目標(biāo)男性X染色體或活躍的女性X染色體而發(fā)生突變或失活[2]。WTX基因最初從腎Wilms瘤患者中發(fā)現(xiàn)，目前對WTX的研究主要集中于Wilms瘤方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)Wilms瘤中WTX的突變是其主要失活機制，Wilms瘤中WTX基因以Wnt/β-catenin信號通路為作用靶點。WTX通過與APC結(jié)合，誘導(dǎo)β-catenin蛋白的降解而抑制Wnt信號通路的傳導(dǎo)[4]。已知Wnt/β-catenin信號通路是一個由多種分子參與、相互影響、相互制約和協(xié)同作用的復(fù)雜體系，對細(xì)胞增殖和分化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理病理有重要調(diào)節(jié)作用[5]。WTX突變導(dǎo)致其喪失對Wnt/β-catenin信號通路的負(fù)性調(diào)控作用，而促進Wilms瘤的進展[6,7]?；谝职┗騑TX的研究現(xiàn)狀，全面了解WTX基因功能可能為惡性腫瘤(尤其是結(jié)直腸癌)發(fā)生發(fā)展機制的研究提供新的依據(jù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)WTX表達缺失，可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。2015年2月，我們通過構(gòu)建WTX穩(wěn)定干擾慢病毒載體，在小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞中建立穩(wěn)定干擾慢病毒的細(xì)胞系，為體內(nèi)體外研究抑癌基因WTX在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供分子生物學(xué)工具。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞系為南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系自存；WTX慢病毒上清購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，RMPI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自澳洲BI；RNA提取試劑RNAisoTM Plus購自日本TaKaRa公司，WTX多克隆抗體購自AbGene，β-actin單克隆的抗體購自廣州市中杉金橋公司；WTX和GAPDH引物來自Invitrogen公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自南京凱基生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)直腸癌SW620、HT29、SW480、HCT116細(xì)胞系用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，于常溫37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，選取處于生長對數(shù)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進行實驗，當(dāng)細(xì)胞生長密度至80%～90%飽和時，用2.5%含EDTA的胰酶消化傳代。

1.3 慢病毒顆粒感染小鼠結(jié)直腸癌CT26細(xì)胞 將生長狀態(tài)良好的CT26細(xì)胞鋪24孔板，細(xì)胞密度30%～50%，細(xì)胞分為目的組與陰性對照組，用含10%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，實驗組每孔加入 5～10 μL 滴度為2×108的WTX慢病毒上清，混合加入 1～2 μL polybrene；陰性對照組每孔加入 1～2 μL 滴度為8×108的Negative Control 慢病毒上清, 加入同目的組等體積polybrene。孵育8～12 h，使用含 10%胎牛血清的RPMI1640全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)孵育 48～72 h。感染72～96 h后，熒光顯微鏡下初步觀察并判斷感染效率，準(zhǔn)備G418藥物篩選。

1.4 G418篩選濃度測定及WTX感染穩(wěn)定細(xì)胞系的建立 以未經(jīng)感染的小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26對G418最佳用藥濃度進行篩選，將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于24孔板， 待次日細(xì)胞密度達50%～70%時， 更換培養(yǎng)基并加入濃度分別為500、 800、 1 000、 2 000、 3 000 ng/mL的G418開始篩選，以10～14 d內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最低濃度定為最佳篩選濃度。篩選結(jié)果確定G418最佳用藥濃度為800 ng/mL。將慢病毒感染后的結(jié)直腸癌細(xì)胞，按 50%～70%密度接種于6孔板，鋪板24 h后，按比例加入濃度為800 ng/mL的G418，細(xì)胞生長達90%時可用含G418的培養(yǎng)基傳代繼續(xù)培養(yǎng)，維持藥物濃度持續(xù)培養(yǎng)10～14 d，并在對照組細(xì)胞全部死亡時終止篩選。得到慢病毒穩(wěn)定感染的細(xì)胞系。

1.5 WTX基因mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。將分選后的目的及對照組細(xì)胞，48 h后分別提取RNA ，qPCR 檢測WTX的表達。將處于對數(shù)生長期、生長密度達80%～90%狀態(tài)良好的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2遍，按1 mL/10 cm2瓶壁面積加入適量TRIzol試劑，反復(fù)吹打裂解5 min，裂解液移至去RNAase/DNAase free的1.5 mL EP管；于EP管中，按0.2 mL氯仿/1 mL TRIzol比例加入氯仿，振蕩混勻，冰上放置10 min，4 ℃，12 000 g離心15 min后，裂解液分為明顯三層，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的RNAase/DNAase free離心管中，加入與水相等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，將管底白色沉淀用75%乙醇洗滌一次，12 000 r/min離心5 min，室溫放置至自然干燥，最后用適量DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度儀檢測RNA濃度。冰上融解基因反轉(zhuǎn)錄所需的試劑，短暫離心混勻之后放置于冰上待用。按照TaKaRa (PrimerScriptTMRT Reagent Kit)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書，配置反應(yīng)體系，PCR儀設(shè)置反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，-20 ℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR檢測目的細(xì)胞以及對照細(xì)胞中WTX相對表達量，GAPDH做內(nèi)參。引物的設(shè)計使用Primer 5.0軟件，引物序列如下：WTX F：5′-GACCCAAAAGGATGAAGCT-3′，R：5′-CCCCTCCAAAGAAACTAGGC-3′；GAPDH F：5′-ACAGCCCGCAGGATCAGGAAA-3′，R：5′-AACACGCTTCACGGGCACTC-3′。

1.6 細(xì)胞系中WTX基因蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗2～3次，將洗液棄去，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液(裂解液的配制∶裂解液∶PMSF混合液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=1 mL∶10 μL∶1 μL∶5 μL)，超聲波裂解3～5 s后，冰上靜置10 s，如此重復(fù)超聲3～5次；冰上靜置裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白濃度測定根據(jù)Pierce公司BCA Protein Assay Reagent Kit說明書進行。將BCA法檢測樣品的蛋白濃度。配制8%的SDS-PAGE凝膠，將蛋白100 ℃變性5 min后，以40 μg的蛋白質(zhì)量上樣，100 V恒壓電泳，直至通道內(nèi)溴酚藍跑到凝膠底部預(yù)定位置，電泳分離后切取目的條帶，濕法轉(zhuǎn)膜2 h電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間結(jié)束后，取出PVDF膜甲醇固定3 min后，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一定稀釋比例的一抗(WTX 1∶200)4 ℃孵育過夜， PBST清洗3 min×5次，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(山羊抗兔IgG抗體， 1∶5 000)室溫孵育 1 h，PBST 清洗 3 min×5 ，將ECL工作液均勻覆蓋PVDF膜上，置入熒光成像儀內(nèi)曝光觀察。GAPDH做內(nèi)參。

1.7 細(xì)胞系構(gòu)建的裸鼠皮下瘤組織中WTX基因蛋白表達檢測 采用免疫組織化學(xué)法。取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的細(xì)胞用于皮下成瘤實驗，待細(xì)胞生長密度達到80%～90%時，胰酶常規(guī)消化后反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞計數(shù)；以1107 個細(xì)胞終體積100 μL打入3～5周齡雌性BALB/C鼠的右下側(cè)背部；密切觀察小鼠，待7 d后皮下瘤子長出后，每隔2 d用游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤體積并記錄數(shù)據(jù)；30 d后處死小鼠，分離皮下腫瘤組織，將腫瘤組織放入10%中性甲醛中固定24～72 h，進行組織脫水、包埋。HE染色檢測原位瘤體積大小，觀察原位瘤組織細(xì)胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，免疫組化法檢測WTX基因蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件。采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒顆粒感染及G418藥物篩選 將CT26細(xì)胞以30%～50%的密度鋪入24孔板，貼壁后每孔細(xì)胞加入15～25 μL慢病毒液，感染48 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可見到綠色熒光，感染效率為40%～50%。根據(jù)已經(jīng)篩選好的藥物濃度，加入濃度為800 ng/mL G418，藥物篩選28 d后在熒光顯微鏡下觀察帶綠色熒光細(xì)胞單克隆形成，挑單克隆擴大培養(yǎng)，獲得慢病毒穩(wěn)定干擾WTX的細(xì)胞系CT26.shW。

2.2 穩(wěn)定感染細(xì)胞株mRNA及蛋白水平定量分析鑒定 CT26.shW及對照細(xì)胞CT26.SCR中WTX mRNA的表達效率分別為0.406 1、1.001 9，WTX mRNA在CT26.shW 組中的表達明顯低于CT26.SCR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blotting檢測WTX蛋白在CT26.shW 細(xì)胞系中的表達效率，結(jié)果提示：在GAPDH做loading control 的基礎(chǔ)上，WTX蛋白在CT26.shW 細(xì)胞中的表達明顯降低。CT26.shW及對照細(xì)胞CT26.SCR中WTX 蛋白的表達效率分別為4.761 9、259 998.999 9，二者結(jié)果綜合提示結(jié)直腸癌WTX穩(wěn)定沉默表達細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.3 HE對穩(wěn)定感染細(xì)胞系構(gòu)建的皮下瘤組織細(xì)胞形態(tài)觀察及皮下瘤組織中蛋白水平 將處理組細(xì)胞所形成的部分皮下瘤，經(jīng)常規(guī)HE染色觀察皮下瘤組織結(jié)構(gòu)，與對照組相比，CT26.shW皮下瘤組織中，細(xì)胞分化差，形態(tài)呈多態(tài)性，核分裂多，異型性明顯。經(jīng)常規(guī)免疫組織化學(xué)實驗檢測，結(jié)果與對照結(jié)直腸皮下瘤組織相比，WTX在CT26.shW皮下瘤組織中低表達。體內(nèi)水平證明WTX干擾細(xì)胞系建立成功。

3 討論

結(jié)直腸癌是當(dāng)今全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率分別位于惡性腫瘤中第三位和第四位[8]。每年新確診的病例數(shù)已增至120萬，并有超過50%的病患最終死于結(jié)直腸癌及其并發(fā)癥[9]。結(jié)直腸癌在各地區(qū)的發(fā)病率有明顯差異，由于生活習(xí)慣等原因，西方國家的發(fā)病率普遍高于亞、非地區(qū)[10]。然而近年來，隨著國內(nèi)生活水平提高，飲食方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢[11]。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個由多種基因參與、多個因素影響、經(jīng)歷多個階段的極為復(fù)雜的生物學(xué)過程。眾所周知癌基因及抑癌基因均參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括癌基因的激活、抑癌基因的缺失或突變失活，MMR的突變及失活，其中抑癌基因的失活發(fā)揮重要作用[12]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)受到胞外信號與各種胞內(nèi)信號的影響，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化、凋亡及幸存機制出現(xiàn)紊亂，其中有大量的生長因子及其受體參與調(diào)控，某些生長因子還可作為胞外信號通過與膜受體結(jié)合，觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。目前已知的與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因包括， APC[13]、p53[14]、DCC[15]、MMR等，原癌基因有k-ras[16]、c-myc[17]等，已發(fā)現(xiàn)參與作用的主要分子通路為 Wnt/β-catenin信號通路。

2007年Rivera等在腎母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，位于X染色體上的一個基因發(fā)生了體細(xì)胞缺失，該基因是研究者發(fā)現(xiàn)的首個位于X染色體上的抑癌基因，Rivera等將其命名為WTX(又稱作FAM123B、AMER1)。由于WTX基因位于X染色體上，且人類所有的X染色體只帶有一個功能等位體，因此對于男性而言，X染色體一個單突變就會使抑癌基因沉默，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。女性擁有兩條X染色體，但在正常生長發(fā)育過程中，一條X染色體失活，導(dǎo)致位于該條X染色體上的基因沉默，如果WTX基因的突變發(fā)生在女性有活性的X染色體上，則可導(dǎo)致女性成為腎母細(xì)胞瘤患者。WTX基因的這種“one-hit”特性預(yù)示著抑癌基因在腫瘤形成過程中的作用可能有某種新的方式。目前對WTX作用機制的相關(guān)研究并不多，主要集中在腫瘤中WTX突變率及缺失率的檢測，如合并有顱骨硬化癥的條紋狀骨病[18,19]、白血病[20]、消化道腫瘤和腎上腺皮質(zhì)瘤等[21]。本研究用慢病毒感染小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞CT26，采用G418藥物篩選穩(wěn)定感染克隆，最終得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞系。qRT-PCR 與 Western blotting 的結(jié)果證實，與對照組細(xì)胞CT26.SCR相比，穩(wěn)定感染后的細(xì)胞CT26.shW中WTX基因的 mRNA與蛋白表達均出現(xiàn)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化結(jié)果證實，由穩(wěn)定感染后的細(xì)胞CT26.shW建立的小鼠皮下瘤組織中，WTX蛋白表達明顯下降，綜合以上結(jié)果表示，結(jié)直腸癌內(nèi)WTX穩(wěn)定過表達細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的進一步實驗。

綜上所述，本試驗成功建立了小鼠結(jié)直腸癌WTX穩(wěn)定干擾的CT26細(xì)胞系， 為后續(xù)研究WTX在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制提供了分子基礎(chǔ)工具，對揭示W(wǎng)TX功能機制、結(jié)直腸癌進展機理和臨床治療新方法的發(fā)現(xiàn)等方面均有重要意義。

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Establishment of a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene

WANGLei1,ZHANGQingling

(1NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective Using a WTX gene recombinant lentivirus interference vector to infect the mouse colorectal cancer CT26 cell line to establish a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene.Methods The recombinant lentiviral was transformed in mouse colorectal cancer CT26 cells, and fluorescence microscopy was used to observe the preliminary infection efficiency. The stably transfected cells were selected with G418. The cellular expression of WTX mRNA was detected using quantitative PCR and the cellular expression of WTX protein was detected by immunohistochemistry and Western blotting. Results After the mouse colorectal cancer CT26 cells were infected by lentiviral, the expression levels of WTX mRNA and protein were significantly decreased in CT26 cells, indicating a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX gene was successfully established. Conclusion We successfully established a mouse colorectal cancer CT26 cell line with stable interference of WTX by lentiviral infection.

colorectal carcinoma; WTX gene; lentivirus vector; stable transfection

國家自然科學(xué)基金資助項目(81272760；81472712)。

王蕾(1990-)，女,主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要研究方向為肺癌轉(zhuǎn)移。E-mail：550706856@qq.com

張慶玲(1970-)，女,教授，博士生導(dǎo)師,主要研究方向為腫瘤機制并動物模型建立。E-mail：zqllc8@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.004

R735.3

A

1002-266X(2017)09-0012-04

2016-12-24)