選擇性剪接與無義介導的mRNA降解機制研究進展＊

陳 彬，孫 玨，謝曼麗，趙愛光，陳偉霞

人類基因數(shù)目遠少于蛋白質(zhì)種類，mRNA的選擇性剪接（alternative splicing，AS）是增加蛋白質(zhì)種類和數(shù)量，使有限基因表達出更多蛋白質(zhì)的主要機制［1－3］。AS 還與無義介導的 mRNA 降解（nonsense mediated mRNA decay，NMD）機制相偶聯(lián)，當某種基因表達異常升高時，通過AS產(chǎn)生能被NMD降解的mRNA剪接異構(gòu)體而下調(diào)該基因表達，使其維持在正常范圍。已知AS和NMD與人類多種遺傳病和癌癥發(fā)生密切相關［4，5］。 現(xiàn)就 AS和 NMD 作用機制做一簡要綜述。

1 選擇性剪接（AS）

人類基因由編碼蛋白質(zhì)的外顯子（exon）和不編碼的內(nèi)含子（intron）共同構(gòu)成?；虺跏嫁D(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱為前體 mRNA（pre－mRNA），同樣由外顯子和內(nèi)含子共同構(gòu)成，需要通過AS進而形成成熟的mRNA。在AS中前體mRNA通過不同剪接方式產(chǎn)生具有不同外顯子含量的mRNA剪接異構(gòu)體。通過AS形成不同的成熟mRNA剪接異構(gòu)體，進而翻譯成結(jié)構(gòu)和功能相似或相反的蛋白質(zhì)。人類基因約92%～94%［6］存在選擇性剪接現(xiàn)象。

1.1 前體mRNA選擇性剪接的基本機制 AS的過程包括兩個步驟：（1）內(nèi)含子套索的形成，即內(nèi)含子5'端與該內(nèi)含子3'端上游分支位點一個 “A”堿基結(jié)合；（2）內(nèi)含子套索前面一個外顯子3'端連接到后一個外顯子5'端，從而完成內(nèi)含子的剪切和外顯子的拼接。 剪接體（spliceosome）包括 U1、U2、U4、U5和U6五種小核糖核蛋白復合體 （small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNPs），以及以 SR 蛋白和 hnRNP 蛋白為主的多種非 snRNP 相關蛋白［7－9］。

剪接體形成開始于UlsnRNP結(jié)合至5'剪接位點和 SF1（splicing factor 1）、U2snRNP 結(jié)合至 3'剪接位點處的分支點 （branch point sequence，BPS），其中U2snRNP的結(jié)合需輔助因子U2AF（U2snRNP auxiliary factor），U2AF 由 65kDa和 35kDa兩個亞基組成，U2AF65結(jié)合到多聚嘧啶區(qū)（polypyrimidine tract，PPT），U2AF35 識別 3'剪接位點的 AG，然后U2snRNP結(jié)合到分支點上，從而形成剪接前體。進一步在ATP作用下U4/U6、U5snRNPs及一系列的非snRNP剪接因子增加到剪接體中，從而完成剪接體組裝過程。經(jīng)過兩個連續(xù)轉(zhuǎn)酯反應完成內(nèi)含子的剪切和外顯子的拼接［10］。

1.2 選擇性剪接主要方式 AS主要有5種方式：（1）外顯子跳讀，即剪接掉一個或多個外顯子；（2）5'和3'剪切位點的選擇，即通過對5'剪切供點或3'剪切受點的選擇，而保留或剪切掉某一外顯子的全部或部分序列；（3）互斥外顯子，即經(jīng)過剪接后，兩個外顯子不能同時出現(xiàn)在同一個轉(zhuǎn)錄本中；（4）對5'和3'末端進行的選擇性剪接，該區(qū)域的變化會對mRNA穩(wěn)定性及蛋白表達有影響；（5）內(nèi)含子保留，即保留或剪切掉一段內(nèi)含子序列。

1.3 選擇性剪接的調(diào)控機制 AS受多種順式作用元件和反式作用因子相互作用調(diào)控［11］。

1.3.1 順式作用元件 順式作用元件主要有外顯子剪接增強子 （exon splicing enhancers，ESEs）、內(nèi)含子剪接增強子 （intronic splicing enhancers，ISEs）、外顯子剪接沉默子（exon splicing silencers，ESSs）和內(nèi)含子剪接沉默子 （intronic splicing silencers，ISSs），分別促進或抑制對特定剪接的選擇。

1.3.2 反式作用因子 調(diào)控AS的反式作用因子主要有SR（serine－arginine rich）蛋白家族和核不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）家族。 SR 蛋白通常作為激活蛋白［12］，而hnRNP蛋白則作為抑制蛋白。（1）SR蛋白家族。SR蛋白家族包括SR蛋白和SR相關蛋白。SR蛋白家族含有1個或2個RNA識別基序（RRM），并在C端有富含絲氨酸/精氨酸的RS區(qū)域。SR蛋白與RNA的結(jié)合活性由RRM決定，RS區(qū)域則決定了蛋白質(zhì)間的相互作用。（2）hnPNP蛋白家族。在AS的負調(diào)控中，hnRNP能與抑制元件相互作用，通過與新生mRNA結(jié)合而發(fā)揮抑制AS的作用?，F(xiàn)研究最清楚的hnPNP蛋白為多聚嘧啶區(qū)域結(jié)合蛋白1（polypyrimidine tract binding protein1，PTBP1）。PTBP1通過與U2AF競爭結(jié)合多聚嘧啶區(qū)域，對3'剪接位點起負調(diào)控作用；還能抑制5'剪接位點，并包裹外顯子使其不與剪接體結(jié)合而產(chǎn)生外顯子跳讀［13－15］。

很多基因的 AS 都受到 PTBP1 的調(diào)節(jié)［16，17］。PTBP1有兩種旁系同源蛋白—PTBP2和PTBP3，同樣對AS起負調(diào)控作用。PTBP1能通過AS和NMD機制來調(diào)節(jié)PTBP2和PTBP3基因的表達水平，沉默PTBP1基因后能上調(diào)PTBP2和PTBP3表達［17］，表明hnPNP蛋白之間可通過AS和NMD途徑相互調(diào)節(jié)。

2 無義介導的mRNA降解（NMD）

NMD 最早由 Losson 等［18］發(fā)現(xiàn)，1999 年 Hentze等［19］在Cell雜志報道后，從此使NMD得到了重視。NMD是一種細胞內(nèi)mRNA監(jiān)控機制，能檢測并快速降解含有無義密碼子 （premature termination codons，PTC）突變的 mRNA［20］。 被 NMD 機制降解的mRNA 均存在PTC，故PTC是mRNA被NMD機制作用的標志。

細胞經(jīng)常會產(chǎn)生帶有PTC的mRNA，這些mRNA一旦翻譯成蛋白質(zhì)，就會導致疾病。含有PTC的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能通過NMD機制被迅速降解，從而阻止有害物質(zhì)——截短蛋白（truncated proteins）的產(chǎn)生［21］，是生物體保護自身的一種途徑。NMD受多種順式作用元件和反式作用因子調(diào)控。

2.1 順式作用元件 識別異常終止密碼子是NMD過程中的關鍵一步，順式作用元件在其中起著重要作用，研究表明無義密碼子是通過它3'的序列來顯示其異常的。

對釀酒酵母研究發(fā)現(xiàn)，PTC下游150～200核苷酸處存在下游序列元件 （downstream sequence element，DSE）［22］， 而正常終止密碼子則沒有該序列，因此能將PTC區(qū)分出來。哺乳動物存在著2種對應DSE的序列：一種是fail－safe序列，見于人丙糖磷酸異構(gòu)酶和β珠蛋白mRNA中；另一種是前體mRNA剪接后產(chǎn)生的外顯子－外顯子連接 （exon－exon junction，EEJ），即 NMD要求 PTC下游至少存在一個內(nèi)含子，這樣剪切掉該內(nèi)含子后才能產(chǎn)生EEJ。

與酵母基因不同，哺乳動物基因中存在大量內(nèi)含子，基因轉(zhuǎn)錄多需剪接加工，除可產(chǎn)生PTC外，還可產(chǎn)生相應的EEJ，因此AS對哺乳動物的NMD作用是必需的。

2.2 反式作用因子 NMD同樣還要一些相關反式作用因子的參與，其中研究最多的是上游移碼突變體（up－frameshift mutant，Upf）［23］。

酵母菌有 3 種 Upf蛋白質(zhì)：Upf1p、Upf2p、Upf3p， 人體中有 4種 Upf蛋白質(zhì)：hUpf1p、hUpf2p、hUpf3ap和hUpf3bp。1個或多個Upf基因缺失型的酵母菌株能同等程度地穩(wěn)定無義突變的mRNA，但對野生型的mRNA的衰變速率無影響［22］。表明Upf蛋白是NMD不可缺少的反式作用因子［24］，且Upf蛋白是以復合物的形式發(fā)揮功能的。Upf1p是一種依賴于ATP的RNA解旋酶，在翻譯提前終止時與真核釋放因子 1（eukaryotic release factor 1，eRF1）和真核釋放因子 3（eukaryotic release factor 1，eRF3）結(jié)合，起到連接翻譯與NMD的作用。Upf2p除了與eRF3相關外，還能結(jié)合Upf1p和Upf3p。Upf3p屬穿梭蛋白，具有聯(lián)系mRNA在核內(nèi)的加工修飾與在胞質(zhì)中NMD的作用［25］。

酵母的Hrp1p是一種RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，可特異結(jié)合DSE，起到對無義mRNA進行標記的作用。當Hrp1基因突變時，Hrp1p無法特異結(jié)合DSE，致使無義mRNA的穩(wěn)定性增高，而且Hrp1p與Upf1p及 Upf2p間存在著互相作用［26］。

哺乳動物細胞中，mRNA中EEJ上游20～24個核苷酸處存在著外顯子連接復合物 （exon－junction complex，EJC），具有標記無義 mRNA 的作用［27］。EJC由 mRNA穿梭蛋白 Y14、MAGON、eIF4A3和 BTZ四種蛋白組成［28，29］，作為一個穩(wěn)固的平臺用于其他組分的錨定，在NMD中發(fā)揮重要作用。

2.3 NMD途徑的作用機制 蛋白質(zhì)表達最后一步是翻譯終止，真核細胞中這個過程是在兩個蛋白因子調(diào)控下完成的：eRF1和eRF3，NMD同樣離不開 eRF1 和 eRF3 的參與［30］。

在哺乳動物細胞中，首先Upf3p與EJC相互作用而附著在mRNA上；隨后Upf2p通過與Upf3p作用被招募到復合體中。正常mRNA在核糖體開始翻譯后，EJC會從mRNA上解離出來，直到核糖體遇到終止密碼子后翻譯停止，如果在終止密碼子后面50～55個核苷酸的位置仍然存在EJC，那么該終止密碼子就是PTC，通過釋放出eRF1－eRF3復合體，招募結(jié)合 Upf1p；在蛋白激酶 SMG－1（suppressor with morphogenetic effect on genitalia－1）的作用下將Upf1p磷酸化。磷酸化的SURF復合體（SMG－1、Upf1p、eRF1和 eRF3）將停滯于PTC 位點的核糖體40 S和60 S亞基解離，從而激活NMD途徑。

3 AS-NMD與惡性腫瘤

惡性腫瘤的發(fā)生與AS異常密切相關，原癌基因、抑癌基因及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關基因均受到AS調(diào)控。原癌基因中Bcl－x的異構(gòu)體Bcl－xL具有抑制細胞凋亡的作用，在多發(fā)性骨髓瘤、小細胞肺癌等多種腫瘤中表達增高。抑癌基因中，前列腺癌中KLF6（Krupple like factor 6）基因的單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP） 增加KLF6的選擇性剪接，引起KLF6－SV1和KLF6－SV2異構(gòu)體在前列腺癌的表達增高，拮抗野生型KLF6的功能，促進腫瘤細胞的生長。與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關的基因中，CD44的選擇剪接異構(gòu)體CD44v5、CD44v6等特異性的與某些腫瘤轉(zhuǎn)移相關，表達陽性的腸型胃癌比CD44v6表達陰性的彌漫型胃癌浸潤生長能力增強［31］。

NMD途徑能迅速地降解mRNA突變體，NMD異常時就產(chǎn)生很多截短蛋白，從而導致多種惡性腫瘤的產(chǎn)生。例如抑癌基因：BRCA1、p53以及 WT1。在 NMD異常時，這些抗癌基因會產(chǎn)生截短蛋白，使得細胞凋亡減少，最終導致癌變的發(fā)生［32］?？梢?，NMD是一種重要的mRNA轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控機制，能夠發(fā)現(xiàn)和降解無義mRNA，防止其對人體產(chǎn)生危害。

AS與NMD關系密切，兩者常相互偶聯(lián)，形成AS－NMD，對維持基因表達水平的穩(wěn)態(tài)起著重要的作用［33，34］。當體內(nèi)一種基因表達水平過高時，正常情況下，機體會通過增強AS，將該基因剪接成一個含有PTC的無義mRNA，再通過NMD機制被降解而下調(diào)其表達水平，維持基因表達的動態(tài)平衡。

綜上所述可見，AS與NMD在人類生理病理過程中均起著重要作用。以往研究往往將兩者分開，目前人們已認識到兩者之間存在著緊密的聯(lián)系?，F(xiàn)越來越多的基因序列分析結(jié)果表明AS－NMD在SR蛋白質(zhì)和hnRNP蛋白質(zhì)中普遍存在［35］。尤其是近年來RNA結(jié)合蛋白PTBP3研究的不斷深入［36－39］，Spellman等認為PTBP3作為PTBP1的旁系同源是一種 AS的調(diào)節(jié)因子［17］，而 Brazao TF等則認為PTBP3則是一種與Upf1類似的NMD相關蛋白［40］，雖然兩者觀點有所分歧，但可以看出AS與NMD之間聯(lián)系密切。AS－NMD的具體作用機制尚未完全闡明，進一步研究有助于對惡性腫瘤等疾病發(fā)病機制的深入認識，并對診斷和治療產(chǎn)生深遠影響。

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