外泌體在兒童支氣管哮喘發(fā)病及診治中的作用研究進展

劉超，汪俊

(1南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌 330006;2江西省人民醫(yī)院)

外泌體在兒童支氣管哮喘發(fā)病及診治中的作用研究進展

劉超1,2，汪俊2

(1南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部，南昌330006;2江西省人民醫(yī)院)

支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，患者多同時伴有可變的氣流受限和氣道高反應(yīng)性。外泌體是一種能被多種細胞所分泌的囊泡小體，包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA等生物活性物質(zhì)，參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答、抗原呈遞、炎癥反應(yīng)和細胞遷移等多種病理生理過程。近年來有研究表明外泌體可參與支氣管哮喘患者的炎癥反應(yīng)過程和細胞間通訊，在支氣管哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮作用。外泌體可能是診斷支氣管哮喘的標志物及治療支氣管哮喘的靶點。

支氣管哮喘；外泌體；白三烯；微小RNA

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。目前全球患病人數(shù)接近3億，且患病率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，預(yù)計到2025年患病人數(shù)將達到4億[1]。目前臨床上治療哮喘主要依靠吸入支氣管擴張劑和激素，但對于中重度哮喘以及激素抵抗性哮喘治療效果欠佳。外泌體是一種納米級的囊泡小體，由多種細胞分泌，存在于支氣管肺泡灌洗液(BALF)、血液、乳汁、尿液及唾液等體液中。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與哮喘的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥細胞的遷移，其中的miRNA參與細胞間通訊。外泌體在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有重要的作用，也是有前景的支氣管哮喘診斷標志物及治療靶點?，F(xiàn)綜述如下。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)、來源及功能

1987年Johnstone等[2]首次從綿羊網(wǎng)織紅細胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了這種囊泡，并將其命名為外泌體。外泌體是直徑40～100 nm的微小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)外膜含有神經(jīng)酰胺、膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂GM3等多種成分，能有效的保護其內(nèi)容物免受酶的降解[3]。外泌體中的蛋白質(zhì)可分為兩種類型：一類是在不同細胞來源的外泌體上均有表達，如四次跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、膜轉(zhuǎn)運及融合蛋白、Tsg101、Alix等；另一類則是特異性蛋白，如與抗原呈遞相關(guān)的主要組織相容性復(fù)合體-Ⅰ(MHC-Ⅰ)和主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)等[4]。外泌體攜帶的核酸主要有mRNA、miRNA等多種遺傳物質(zhì)，可參與細胞間遺傳信息的傳遞。外泌體可以被多種細胞類型所分泌，如B細胞、人樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞、T細胞、上皮細胞及腫瘤細胞等[5]。外泌體也廣泛存在于BALF[5]、血液、乳汁、尿液及唾液[6～9]等體液中。

外泌體在胞內(nèi)體系統(tǒng)中形成。胞內(nèi)體系統(tǒng)由內(nèi)吞囊泡、早期胞內(nèi)體、晚期胞內(nèi)體和溶酶體構(gòu)成；內(nèi)吞囊泡由網(wǎng)格蛋白或非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)，將各種類型的分子運輸?shù)皆缙诎麅?nèi)體，早期胞內(nèi)體與其他膜或囊泡融合后形成晚期胞內(nèi)體[10]，晚期胞內(nèi)體將其排出到細胞外的腔中形成腔內(nèi)囊泡，這些晚期胞內(nèi)體也被稱為多泡體(MVB)。MVB 的形成過程是由ESCRT復(fù)合物(ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ四種可溶性多蛋白復(fù)合物組成)所介導(dǎo)的。最初只是認為MVB和溶酶體融合后以降解相關(guān)蛋白質(zhì)或脂質(zhì)，隨后才進一步發(fā)現(xiàn)MVB能與質(zhì)膜融合后釋放囊泡到胞外，而這些只有納米大小的囊泡就是外泌體[11]。

外泌體在細胞間通訊中發(fā)揮重要的作用，它可以穿過質(zhì)膜將其內(nèi)容物卸載，進而影響受體細胞的表型及功能[12]。不同細胞來源的外泌體，其功能也就不同。例如，Raposo等[13]發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞中可以分離外泌體，并證明外泌體在體內(nèi)表現(xiàn)為抗原呈遞作用，誘導(dǎo)T細胞的反應(yīng)，參與免疫細胞的調(diào)節(jié)。Thery等[14]發(fā)現(xiàn)衍生自抗原呈遞細胞的外泌體能在細胞表面表達MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子，有助于激活CD4+T細胞和CD8+T細胞以誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。Lasser等[15]還發(fā)現(xiàn)外泌體能從鼻腔灌洗液中分離，通過細胞遷移測定分析，證明鼻腔中外泌體可以誘導(dǎo)單核細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞的遷移，因此鼻腔灌洗液的外泌體可以誘導(dǎo)先天性免疫細胞的遷移。

2 外泌體在哮喘發(fā)病中的作用

2.1 參與炎癥反應(yīng) 與哮喘有關(guān)的外泌體產(chǎn)物，主要是巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)[16]、上皮細胞[17]及嗜酸性粒細胞[18]產(chǎn)生，存在于BALF[5]和鼻腔灌洗液(NLF)[19]中。白細胞三烯(LTs)是來源于花生四烯酸AA)的促炎介質(zhì)，在慢性炎癥的發(fā)病機制中起關(guān)鍵性的作用。LTA4是AA通過胞質(zhì)磷酸酶A2從核膜釋放和5-脂氧合酶氧化所形成的中間體，通過LTA4水解酶可以生成LTB4，LTA4通過LTC4合酶形成LTC4[20]。轉(zhuǎn)化因子-β1(TGF-β1)可以參與過敏性炎癥和促進氣道的重塑[21]。Esser等[22]發(fā)現(xiàn)來源于巨噬細胞和DC的外泌體具有LT生物合成的功能性酶，也證明了LTC4合酶及LTA4水解酶存在于外泌體中。TGF-β1趨向于下調(diào)巨噬細胞的CD14、HLA-DR、CD63、ICAM-1等蛋白的水平，說明TGF-β1能降低巨噬細胞中外泌體的蛋白水平；在 Ca2+和AA的刺激下，外泌體產(chǎn)生趨化性類花生酸來誘導(dǎo)粒細胞的遷移，通過增強粒細胞的遷移可以加重哮喘的炎癥反應(yīng)[22]。Paredes等[23]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，輕度樺樹花粉過敏性哮喘患者BALF外泌體CD63、CD81、CD36、HLA-DR蛋白水平明顯高于正常對照組，其在哮喘患者中表現(xiàn)出不同的表型及功能；進一步發(fā)現(xiàn)來自哮喘的BALF外泌體可增加支氣管上皮細胞中LT的形成和IL-8的釋放，而半胱氨酰白三烯受體拮抗劑孟魯司特能降低外泌體誘導(dǎo)的IL-8釋放，因此BALF外泌體也具有LT生物合成能力，參與哮喘的炎癥反應(yīng)。

Kulshreshtha等[24]研究發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細胞(BEC)是哮喘患者肺中外泌體的主要來源，哮喘小鼠BEC分泌的外泌體及其相關(guān)蛋白(CD63、Rab-27b、Tsg-101和Alix)高于正常小鼠；在IL-13的影響下，BEC分泌的外泌體可以誘導(dǎo)單核細胞(未分化的巨噬細胞)的增殖和趨化來加重炎癥反應(yīng)。Canas等[25]發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞通過增加外泌體的釋放參與哮喘的炎癥反應(yīng)，同時外泌體能誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞中NO及ROS產(chǎn)量增加，加重炎癥反應(yīng)；研究也進一步證實外泌體可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細胞的遷移及黏附，并引起黏附分子如ICAM-1和integrin α2的特異性表達增強，因此外泌體在嗜酸性粒細胞中發(fā)揮的主要效應(yīng)是作為趨化因子。

2.2 參與細胞間通訊 外泌體是微小的囊泡，通過胞吞作用，攜帶miRNA進入受體細胞與之結(jié)合從而介導(dǎo)細胞間的通訊。循壞外泌體miRNA在體液或細胞中是相對穩(wěn)定的，外泌體可以保護miRNA免于RNA酶的降解。Pegtel等[26]證明被感染的B細胞分泌外泌體中存在成熟EBV編碼的miRNA；通過外泌體轉(zhuǎn)移的外源EBV-miRNA被遞送到受體細胞中，導(dǎo)致受體細胞中miRNA靶向基因的抑制。Valadi等[27]發(fā)現(xiàn)來源于人和小鼠的肥大細胞中存在外泌體RNA，而且來源小鼠肥大細胞的外泌體可以將RNA轉(zhuǎn)移到另一個小鼠的肥大細胞中，繼而在受體細胞中發(fā)現(xiàn)新的蛋白，表明轉(zhuǎn)移的RNA能從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞中進行翻譯，說明轉(zhuǎn)移的RNA是有功能的。

Levanen等[28]首次發(fā)現(xiàn)輕度間歇性哮喘患者與健康者BALF外泌體中24種miRNA表達存在差異，包括let-7家族成員及miRNA-200家族成員，大多數(shù)miRNA下調(diào)。

3 外泌體在哮喘診斷及治療中的應(yīng)用效果

外泌體內(nèi)蛋白miRNA表達比細胞內(nèi)穩(wěn)定性更高，因此可用于疾病的早期診斷[12]。外泌體已被作為腫瘤早期診斷的標志物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液中has-miR-21的上調(diào)是肺癌早期診斷的生物標志物。乳腺癌細胞株MDA-MB-231外泌體中miR-105水平明顯高于正常乳腺上皮細胞，因此外泌體中miR-105可作為早期診斷乳腺癌的生物標志物[31]。

Mazzeo等[18]發(fā)現(xiàn)哮喘患者嗜酸性粒細胞外泌體的釋放量高于正常對照組，并且在IFN-γ刺激后，外泌體相關(guān)蛋白表達量升高，這說明外泌體很參與了哮喘的發(fā)病過程，而嗜酸性粒細胞外泌體中相關(guān)蛋白很可能是哮喘診斷的生物標志物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)哮喘患者呼出氣冷凝液外泌體中11種miRNA表達高于健康人，其中has-miR-574-5p、has-miR-516a-5p、has-miR-421涉及哮喘相關(guān)通路。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，OVA喂養(yǎng)的小鼠血清中的耐受性外泌體可以顯著降低嗜酸性粒細胞浸潤及血清IgE的水平，可抑制TH1和Th2主導(dǎo)的免疫應(yīng)答，證明外泌體能誘導(dǎo)免疫耐受，因此外泌體可能為過敏性反應(yīng)的治療提供潛在的治療靶點。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗原耐受性小鼠鼻內(nèi)給予外泌體可以防治過敏性反應(yīng)，其通過抑制IgE應(yīng)答、Th2細胞因子的產(chǎn)生及氣道炎癥來實現(xiàn)，還提出以外泌體為載體的抗過敏疫苗可應(yīng)用于過敏性疾病的治療。另一項研究卻表明，外泌體抑制劑GW4869的使用明顯降低了BALF中浸潤細胞的數(shù)目、血清IgE及炎癥因子(IL-13、IL-4、IL-5)的水平，而哮喘的氣道高反應(yīng)性及氣道炎癥也相應(yīng)的緩解[24]。

綜上所述，外泌體在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用，但外泌體具體通過哪些信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而在哮喘中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。呼出氣體冷凝液中外泌體miRNA具有成為哮喘早期診斷的生物標志物的可能，但其診斷效果還需要研究證明。外泌體可能作為一種新型的靶向藥物或者疫苗應(yīng)用于哮喘的治療，但目前只是一種推測，暫未應(yīng)用臨床工作中。

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汪俊(E-mial：wangjun5087@163.com)