細(xì)菌室能力評(píng)價(jià)中考核盲樣檢測(cè)分析

余慧宏，魏建萍，涂智杰，胡芹，黃潔瓊，宋建新

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是由專門機(jī)構(gòu)采用一系列辦法，比較和評(píng)價(jià)地區(qū)間、省內(nèi)或全國(guó)范圍內(nèi)的各實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)質(zhì)量。近十年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)參加了不同范圍室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的病原微生物檢測(cè)能力考核，大多數(shù)考核方式為盲樣中分離鑒定致病菌，最近一次細(xì)菌室能力評(píng)價(jià)考核，則是同時(shí)對(duì)三個(gè)類別的考核盲樣進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將考核情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)室參加江西省疾病預(yù)防控制中心細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)價(jià)考核時(shí)，發(fā)放的考核盲樣，編號(hào)為F1-F4。盲樣F1需進(jìn)行腸道、呼吸道病原菌檢測(cè)，病原菌鑒定到種或型；盲樣F2進(jìn)行核酸檢測(cè)，考核范圍為腸道病原菌，須鑒定到屬；盲樣F3、F4進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)（布?。?。

1.2 主要試劑和儀器 血平板、巧克力色血瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；顯色培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余干粉培養(yǎng)基均由青島海博試劑有限公司生產(chǎn)；ID32E腸桿菌科生化鑒定試劑條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；沙門菌屬診斷血清（60種）由寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司提供；核酸檢測(cè)試劑盒由江蘇碩世生物科技有限公司生產(chǎn)；虎紅平板凝集抗原和試管凝集抗原由江西省疾控中心提供；法國(guó)生物梅里埃ATB細(xì)菌鑒定儀、菌液比濁儀、美國(guó)ABI 7300型熒光PCR儀。

1.3 方法 依據(jù)GB4789-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》[1]；WS269-2007 《布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]；《霍亂防治手冊(cè)》（第6版）[3]，以及《發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測(cè)方案》、《腦炎腦膜炎癥候群監(jiān)測(cè)方案》、《腹瀉癥候群監(jiān)測(cè)方案》（2012年版）進(jìn)行檢測(cè)。

2 檢驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果

2.1 F1考核盲樣病原菌分離 病原菌檢測(cè)分離培養(yǎng)平板，置于5%二氧化碳環(huán)境，36℃恒溫培養(yǎng)24h。血平板上生長(zhǎng)出單一的灰白色、中等大小、不溶血、濕潤(rùn)的菌落，未見產(chǎn)生金黃色、藍(lán)綠色等色素；巧克力色血瓊脂平板上生長(zhǎng)出單一的灰白色、中等大小的菌落。

置于有氧環(huán)境，36℃恒溫培養(yǎng)24h，麥康凱平板上生長(zhǎng)出表面光滑、濕潤(rùn)、無(wú)色半透明菌落；伊紅美蘭平板上生長(zhǎng)出淡紅接近無(wú)色的，半透明圓形菌落；科瑪嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出紫紅色、表面濕潤(rùn)的圓形菌落[4]；血平板上生長(zhǎng)的菌落與置于5%二氧化碳環(huán)境中的菌落形態(tài)一致。TCBS、慶大霉素瓊脂平板接種原點(diǎn)處有少許菌苔，由于平板的強(qiáng)選擇性抑制作用，未沿著接種線生長(zhǎng)出菌落。

從每塊長(zhǎng)有菌落的平板上觀察，菌落形態(tài)很一致，屬于同一類型菌，從菌落大小、規(guī)則程度以及透明度上找差別，挑取血平板上多個(gè)菌落進(jìn)行染色，均為無(wú)芽胞、莢膜的革蘭陰性桿菌，氧化酶陰性。挑取5個(gè)菌落，接種三糖鐵，培養(yǎng)后結(jié)果均為k/A、產(chǎn)氣、硫化氫陽(yáng)性。

經(jīng)梅里埃生化分析系統(tǒng)（ATB）鑒定為沙門菌屬，極好的鑒定（%ID：99.9 T 值：0.81）。噬菌體試驗(yàn)呈現(xiàn)出O-I噬菌體裂解，C多價(jià)、E多價(jià)噬菌體均不裂解模式。血清學(xué)鑒定均為A～F多價(jià)，O8，Hr凝集，鹽水對(duì)照無(wú)自然凝集。誘導(dǎo)后得出血清型，為黃金海岸沙門菌（8：r：l，w）。

2.2 F2考核盲樣熒光PCR檢測(cè) 按試劑說(shuō)明書配制霍亂弧菌；霍亂弧菌01群；霍亂弧菌0139群；霍亂弧菌CTX基因檢測(cè)4種反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 10s→55℃ 40s；40 次循環(huán)。 檢測(cè)霍亂弧菌0139群，待測(cè)盲樣擴(kuò)增曲線呈S型，且Ct值為15.76，判定為霍亂弧菌0139群核酸檢測(cè)陽(yáng)性。檢測(cè)霍亂弧菌CTX毒力基因，Ct值為16.05，判定為霍亂弧菌CTX毒力基因檢測(cè)陽(yáng)性[5，6]。

盲樣F2檢測(cè)出帶有CTX毒力基因的0139群霍亂弧菌。

2.3 F3、F4考核盲樣血清學(xué)檢測(cè)（布病） 虎紅平板凝集試驗(yàn)：從編號(hào)F3、F4盲樣管中，分別取0.03ml血清滴于玻片上，各加入虎紅平板凝集抗原0.03ml，搖勻后，在5min內(nèi)判定結(jié)果為F3盲樣陰性，F(xiàn)4盲樣陽(yáng)性。

試管凝集試驗(yàn)：⑴將編號(hào)F3、F4盲樣管中每份血清用9支小試管，第一管加2.3ml生理鹽水，第二管不加，第三至第九管各加0.5ml。⑵取被檢血清0.2ml，加入第一管中，混勻后，吸取1ml加入第二和第三管各0.5ml，吸取第三管混勻后的血清0.5ml加入第四管，依次稀釋至第八管，混勻后，吸取0.5ml棄去。⑶從第二管至第九管，每管加入用生理鹽水作1：10稀釋的抗原液0.5ml混勻。第一管不加，作為血清對(duì)照。全部試驗(yàn)管置37℃溫箱恒溫22h，取出放室溫2h觀察結(jié)果。

F3盲樣試驗(yàn)管，除第一管血清對(duì)照管液體清亮，其余八管液體渾濁，無(wú)凝集。F4血清的第二、三試驗(yàn)管完全凝集；第四管幾乎完全凝集，上層液75%清亮；第五管有微量凝集，液體25%清亮；第六至第九管均液體渾濁，無(wú)凝集。

F3血清試管凝集試驗(yàn)為陰性，F(xiàn)4血清試管凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性，效價(jià)為1：100。

3 討論

盲樣考核是對(duì)檢測(cè)人員技能、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制情況的一種檢驗(yàn)[7]。須認(rèn)真做好儀器設(shè)備檢定和維護(hù)工作，所用培養(yǎng)基、診斷血清的質(zhì)量控制，按要求配制、貯存培養(yǎng)基，按照無(wú)菌操作程序進(jìn)行，對(duì)操作人員有最基本且重要的技能要求，需使用干濕適度的平板，采用恰當(dāng)?shù)膭澗€方法接種，分出盡量多的單菌落，單個(gè)菌落過(guò)少容易造成漏檢，并且難于開展純培養(yǎng)。為確保營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、弱選擇性培養(yǎng)基有較好分離效果，可平行使用兩塊平板進(jìn)行劃線接種。

培養(yǎng)基是培養(yǎng)微生物的必需品，是對(duì)病原菌分離鑒定的重要環(huán)節(jié)和必不可少的手段。選擇考核所用培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)先研讀考核樣品作業(yè)指導(dǎo)書，明確要求及考核范圍，應(yīng)滿足樣品中目的菌所需營(yíng)養(yǎng)要求，盡量減少干擾菌的影響及快速鑒定的需要，建議選用對(duì)目的菌有明確指示作用的顯色培養(yǎng)基。直接分離時(shí)可用血平板，其適于多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)，接種培養(yǎng)后，觀察菌落形態(tài)的差別，對(duì)初步判斷樣品中可能存在幾種類型菌，有一定的參考意義，從而不易漏檢。樣品直接分離的平板上，僅存在單一形態(tài)菌落，也應(yīng)盡量多挑取，因分屬不同型別的細(xì)菌，可呈現(xiàn)相似菌落，不易區(qū)分，需鑒定后，證實(shí)是否存在不同型別的菌。

本次考核檢測(cè)鑒定的細(xì)菌均為應(yīng)急面對(duì)之細(xì)菌，分別為沙門菌、霍亂弧菌和布魯菌。自此次盲樣中分離出的沙門菌，僅出現(xiàn)一相鞭毛抗原，需通過(guò)位相變異試驗(yàn)誘導(dǎo)出另一未知相，才能確定其菌型。日常沙門菌鑒定工作經(jīng)驗(yàn)得知，有些沙門菌經(jīng)簡(jiǎn)易平板法多次試驗(yàn)才可誘導(dǎo)成功，這樣非常耗費(fèi)時(shí)間?？己送怯袝r(shí)間限定的，為了能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)得出沙門菌血清型，便將簡(jiǎn)易平板法作為參考方法，同時(shí)還采用血平板-濾紙條搭橋法[8]，血平板搭橋法不僅直觀，誘導(dǎo)后的沙門菌凝集效價(jià)高，還提前三天時(shí)間得出準(zhǔn)確血清型。用儀器輔助鑒定時(shí)，即使明確提示為某沙門菌菌種，也應(yīng)綜合血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果做出菌型判定。

布魯菌為人獸共患性疾病病原菌，可通過(guò)人體皮膚、呼吸道、消化道進(jìn)入人體引起感染。過(guò)去多見于牧區(qū)，近年來(lái)散發(fā)于大中城市，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，人、畜間布病疫情呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)[9，10]。布魯菌病實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)分為特異性血清學(xué)檢查、分離布氏菌和PCR試驗(yàn)。特異性血清學(xué)檢查包括虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)等，虎紅平板凝集試驗(yàn)可作為初篩試驗(yàn)，適于大量標(biāo)本的篩查。作為唯一國(guó)際全標(biāo)化診斷布病方法的試管凝集試驗(yàn)[11]，進(jìn)行稀釋操作步驟時(shí)，須做到準(zhǔn)確吸取，充分混勻；判斷抗體效價(jià)時(shí)，須認(rèn)真觀察、比對(duì)，試驗(yàn)管輕拿輕放。

總之，全面系統(tǒng)地掌握專業(yè)知識(shí)，更新豐富知識(shí)儲(chǔ)備，積累總結(jié)經(jīng)驗(yàn)[12]，拓寬思路有利于解決檢測(cè)過(guò)程中遇到的問(wèn)題，正確規(guī)范化操作是獲取準(zhǔn)確可靠檢測(cè)結(jié)果的保障。