環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤中的研究進(jìn)展

魯菱嬌，張艷亮 綜述；段勇 審校

引言

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的特殊非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。上世紀(jì)的70年代，人們在研究RNA病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA[1，2]。然而，在circRNA被發(fā)現(xiàn)后的很長一段時(shí)間里，由于檢測技術(shù)的限制，能檢測出的circRNA量非常少，因此circRNA并未引起人們的重視。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，人們通過測序檢測到了各種生物體內(nèi)表達(dá)的circRNA的數(shù)量實(shí)際上是非常龐大的，甚至超過相應(yīng)線性RNA的10倍之多。

20世紀(jì)初，Salmena L等[3]提出了競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)假說，即各種類型的RNA轉(zhuǎn)錄物具有相同miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements，MREs)， 可 競 爭 性 結(jié)合相同的miRNA，從而影響游離miRNA的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。兩年后，Hansen TB等[4]提出circRNA具有類似于miRNA海綿的作用，其可吸附miRNA，從而影響所吸附miRNA對其靶mRNA的作用。由此我們可推導(dǎo)RNA家族中存在著互相調(diào)控的關(guān)系，即：circRNA→miRNA→mRNA。大量研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用，而基于circRNA可吸附miRNA的功能，我們可猜測，circRNA在調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也具有不容忽視的作用。

1 circ RNA的結(jié)構(gòu)、特征及功能

1.1 circRNA的結(jié)構(gòu)、特征 cicrRNA不同于線性RNA，其大多是由編碼蛋白基因的前體mRNA可變剪接產(chǎn)生的，ciricRNA的5'端和3'端直接頭尾相接形成環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)，因此circRNA既無5'端的帽子結(jié)構(gòu)，也無3'端的多聚A尾結(jié)構(gòu)，因?yàn)槿狈ψ杂啥?，因此不能被核酸?nèi)切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定[5，6]。cicrRNA在真核生物中高度表達(dá)，穩(wěn)定存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，大多數(shù)由外顯子序列構(gòu)成[7，8]，也有少部分是由內(nèi)含子序列構(gòu)成，其種類具有跨物種保守性，其表達(dá)具有組織、時(shí)間特異性。

1.2 circRNA的功能 (1)circRNA可作為海綿吸附miRNA是circRNA第一個(gè)被認(rèn)知的功能。在對circRNA 的研究中[4，5]，Memczak S 等提出 circRNA通過自身的miRNA反應(yīng)元件(MREs)與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，解除miRNA對靶mRNA的抑制作用，使靶mRNA的翻譯得以進(jìn)行，由此可見，circRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平[9]。

(2)circRNA可通過與其他RNA堿基互補(bǔ)配對進(jìn)而調(diào)控其他RNA水平，例如，小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物 (antisense to the cerebellar degen-eration-related protein transcript，CDR1as) 能 與CDR1 mRNA互補(bǔ)配對，從而增強(qiáng)CDR7 mRNA的穩(wěn)定性[10]。CDR1as可結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)，抑制靶 mRNA 的作用，從而對其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[5]。

(3)circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA-蛋白復(fù)合物，以此調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的活性[4，5，11-13]，例如，CDR1as能與阿格蛋白(Argonaute，AGO)緊密結(jié)合[4，5]；Yang W 等[13]發(fā)現(xiàn)，circ-Foxo3 不僅具有吸附大量miRNAs的海綿樣作用，circ-Foxo3還可與不同的蛋白相結(jié)合[10，14，15]。 由此可見，circRNA 既可以通過結(jié)合miRNA間接調(diào)控蛋白的功能，又可以通過直接與蛋白結(jié)合而影響蛋白的功能。

(4)circRNA也可以作為翻譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成[16，17]，Wang Y 等[18]發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)入circRNAGFP，可以翻譯成具有完整功能的GFP蛋白，并且這種蛋白可在瞬轉(zhuǎn)后的幾天內(nèi)持續(xù)存在。

(5)circRNA能與pre-mRNA競爭，直接調(diào)控母基因表達(dá)[19]。在細(xì)胞核中，circRNA還可通過與RNA polyII相互作用，調(diào)控母基因的表達(dá)[19，20]。

2 circ RNA與腫瘤

circRNA因具有穩(wěn)定、組織表達(dá)特異性等特性，因此更具有成為腫瘤標(biāo)志物的潛力，其在腫瘤診斷、治療方面的運(yùn)用價(jià)值受到越來越多的關(guān)注。人們分別在肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的特異性表達(dá)的circRNA。

2.1 肺癌 田芳等[21]對6株非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在6株NSCLC細(xì)胞株中均有表達(dá)，其中H2170表達(dá)最高，H1299表達(dá)最低。當(dāng)干擾circHIPK3時(shí)，明顯抑制NCIH2170細(xì)胞增殖，而過表達(dá)circHIPK3可促進(jìn)NCI-H1299細(xì)胞增殖。且過表達(dá)circHIPK3能夠上調(diào)類胰島素1號(hào)增長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）的表達(dá)水平，干擾circHIPK3導(dǎo)致IGF-1表達(dá)水平下調(diào)。Zhu X等[22]用芯片篩選出肺腺癌組織中特異性表達(dá)的circRNAs，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNAs中上調(diào)的有39個(gè)，而下調(diào)的有20個(gè)，并進(jìn)一步證實(shí)了hsa_circ_0013958在所有的肺腺癌患者的癌組織、血漿中均顯著上調(diào)，他們還發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0013958的表達(dá)水平與肺腺癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲減hsa_circ_0013958后可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡。此外，hsa_circ_00139 58還可發(fā)揮其海綿作用吸附miR-134，以此阻礙miR-134對cyclinD1的抑制作用，而cyclinD1在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展中具有重要作用。Yao JT等[23]對101位NSCLC患者的癌和癌旁正常組織進(jìn)行circRNA_100876的表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的癌組織顯著上調(diào)，且與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，他們提出circRNA_100876可能作為NSCLC潛在的生物學(xué)標(biāo)志物或NSCLC的治療靶點(diǎn)。

2.2 胃癌 Lai ZY等[24]對胃癌組織和癌旁組織差異表達(dá)的mRNA和差異表達(dá)的circRNA的檢測，通過 分析發(fā)現(xiàn) hsa_circ_0047905、hsa_circ_0138960和has-circRNA7690-15在胃癌組織中高表達(dá)，且在 胃 癌 細(xì) 胞 中 敲 減 hsa_circ_0047905，hsa_circ_0138960和 has-circRNA7690-15后，均可造成相應(yīng)基因的表達(dá)下調(diào)，功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體外抑制這三種circRNAs可抑制胃癌細(xì)胞系的增殖和侵襲。這些均提示hsa_circ_0047905、hsa_circ_0 138960和has-circRNA7690-15可能在胃癌的形成過程中起到促進(jìn)作用。Huang M等[25]首先在20對胃癌及癌旁正常組織驗(yàn)證hsa_circ_0000745的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000745在胃癌組織中下調(diào)，再擴(kuò)大樣本量分別驗(yàn)證60例胃癌患者的胃癌組織和血漿中hsa_circ_0000745的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)無論在胃癌組織中還是血漿中，hsa_circ_0000745均出現(xiàn)下調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而通過ROC曲線證實(shí)血漿中hsa_circ_0000745與癌胚抗原CEA聯(lián)合檢測對胃癌具有良好的診斷價(jià)值。此外，也有證據(jù)表明 circular RNA LARP4[26]、hsa_circ_100269[27]、hsa_circ_0001895[28]在胃癌組織中出現(xiàn)下調(diào)，表明某些circRNA在胃癌的發(fā)展中具有重要作用。

2.3 乳腺癌 Zhang CL等[29]對兩組不同泌乳時(shí)期的老鼠的乳腺組織進(jìn)行circRNA種類的測定，發(fā)現(xiàn)不同泌乳期表達(dá)相同種類的circRNA僅占少數(shù)，而兩個(gè)時(shí)期檢測到circRNA種類大多數(shù)不同，表明在不同的泌乳期，circRNA的表達(dá)具有特異性，由此，研究人員推測，circRNA可為各種類型的乳腺癌的比較提供基礎(chǔ)，且對于特定的乳腺癌或乳腺發(fā)育時(shí)期，我們都可以篩選出特異性的circRNA來進(jìn)行檢測。He R等[30]通過circRNA芯片篩選了三陰乳腺癌細(xì)胞系與人乳腺上皮細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)circGFRA1在三陰乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，通過qPCR驗(yàn)證了circGFRA1在三陰乳腺癌細(xì)胞系和222例三陰乳腺癌患者樣本中的表達(dá)情況，進(jìn)行生存分析后發(fā)現(xiàn)高表達(dá)circGFRA1的預(yù)后更差，他們還發(fā)現(xiàn)敲減circGFRA1后可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，預(yù)測分析結(jié)合熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circGFRA1與GFRA1均可結(jié)合miR-34a，且 circGFRA1與GFRA1的表達(dá)存在相互調(diào)控的機(jī)制。Yin WB等[31]通過對5例乳腺癌和健康志愿者對照組的外周血總circRNA的芯片分析，篩選出差異倍數(shù)超過2倍的circRNA分子有41個(gè)，其中19個(gè)上調(diào)，再通過擴(kuò)大樣本量對20例乳腺癌患者的血清進(jìn)行qPCR驗(yàn)證和ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785可能在乳腺癌的診斷中有一定價(jià)值。

2.4 肝癌 Qin M等[32]對89對肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的hsa_circ_0001649的進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001649在肝癌組織中顯著下調(diào)，此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌中，hsa_circ_0001649表達(dá)與腫瘤大小和腫瘤栓子的發(fā)生有關(guān)系，這些也提示了hsa_circ_0001649可能作為肝細(xì)胞癌的一個(gè)潛在的新的生物標(biāo)志物，并在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。Shi L等[33]運(yùn)用高通量分析了肝癌細(xì)胞中雄激素受體（androgen receptor，AR）對circRNAs表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)AR通過上調(diào)RNA編輯酶ADAR1 p100抑制circRNA的表達(dá)，AR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到ADAR1的啟動(dòng)子區(qū)可上調(diào)ADAR1的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控下游circARSP91表達(dá)，circARSP91可分別在體內(nèi)和體外抑制肝癌細(xì)胞的生長，他們還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ADAR1的肝癌患者預(yù)后不良并且與AR表達(dá)正相關(guān)，這表明了雄激素受體AR通過ADAR1抑制肝癌細(xì)胞中circRNA表達(dá)的分子機(jī)制，對肝癌的診斷和治療具有潛在的意義。

2.5 宮頸癌 Wang H等[34]分析了3例HPV16感染誘發(fā)的宮頸癌和對應(yīng)癌旁組織的全轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)99種差異表達(dá)的circRNAs。Gao YL等[35]通過分析4對宮頸癌組織circRNAs芯片，篩選出45個(gè)高表達(dá)4倍以上的circRNAs分子，再進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量在35對宮頸癌樣本中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證hsa_circ_001828的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001828在宮頸癌組織中顯著高表達(dá)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明敲減hsa_circ_001828后可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲遷移能力，此外，他們通過生物信息學(xué)預(yù)測及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001828可競爭性結(jié)合miR-497從而發(fā)揮原癌基因的功能。

2.6 大腸癌 Wang X等[36]設(shè)計(jì)不同的引物擴(kuò)增hsa_circ_001988，并進(jìn)行測序驗(yàn)證，認(rèn)為hsa_circ_001988可能成為結(jié)直腸癌診斷的一種新的潛在的生物標(biāo)志物并有望成為一個(gè)潛在的新的治療靶點(diǎn)。

3 展望

circRNA的特異性結(jié)構(gòu)賦予了其獨(dú)特的功能，多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)circRNA參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)中不可缺少的信息分子，其在體內(nèi)不僅調(diào)控腫瘤的發(fā)病過程，也廣泛參與其他非癌癥疾病的發(fā)病過程。目前已知，circRNA分子具有物種、組織、時(shí)序特異性，并且高度保守、穩(wěn)定，這些特性提示我們，circRNA具有作為新一代腫瘤監(jiān)測的特異性標(biāo)志物的潛力；同時(shí)，circRNA可直接與miRNA、靶基因以及結(jié)合蛋白相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，為靶向治療腫瘤疾病提供了參考。目前，對circRNA在體內(nèi)的作用機(jī)制的研究較少，雖然已經(jīng)有研究證實(shí)某些circRNA與某些特定腫瘤相關(guān)，但將circRNA作為某種腫瘤特異性標(biāo)志物，運(yùn)用在臨床診斷腫瘤上仍然需要進(jìn)一步的探索。