胰腺和胰島的保存在胰島移植中的研究進(jìn)展

謝艷,王樹森（天津市第一中心醫(yī)院移植中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300192）

1 型糖尿病是器官特異性自身免疫性疾?。?］，胰島移植用于治療1型糖尿病已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，也取得了一定的臨床效果［2-5］。國(guó)際胰島移植登記處的數(shù)據(jù)顯示，移植后胰島素撤離比例從1999-2002年的27%升高到2007-2010年的44%，總體來說，2007-2010年患者胰島移植的效果較1999-2006年有所提高［6］。臨床研究表明，胰島移植后5年仍然不依賴胰島素治療的患者比例可達(dá)60%［7］。目前，胰島移植面臨的問題之一是優(yōu)質(zhì)供體胰腺短缺，尤其是胰腺用于胰島制備前的保存以及胰島培養(yǎng)是影響胰島移植療效的重要因素。因此，如何防止保存期間胰腺損傷和胰島功能下降也成為研究熱點(diǎn)，本文對(duì)胰腺和胰島的保存在胰島移植中的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 胰腺的保存

胰島是利用供體胰腺，通過膠原酶消化、純化等過程制備而來的，胰島制備前需要高質(zhì)量保存供體胰腺。

1.1 胰腺靜態(tài)低溫保存及保存液：無論供體胰腺用于胰腺移植還是分離提純后進(jìn)行胰島細(xì)胞移植，其保存方法主要是靜態(tài)低溫保存［8］。低溫（2～4℃）保存可以通過降低細(xì)胞代謝率、減少氧耗量和三磷酸腺苷（triphosadenine， ATP）的使用來減少缺血損傷［9］。保存液有利于減少低溫帶來的不利影響。常用的保存液主要包括UW液、HTK液和Celsior液。其中UW液目前是靜態(tài)低溫保存（static cold storage， SCS）公認(rèn)的保存液［8-10］，廣泛應(yīng)用于胰島分離前胰腺的獲取和保存［11］。但UW液的缺點(diǎn)是使用之前必須冷藏，其高黏特性可以導(dǎo)致胰腺?zèng)_洗和灌注不充分［12］。另有研究報(bào)道顯示，UW液會(huì)抑制消化過程中膠原酶作用而導(dǎo)致胰島產(chǎn)量和功能下降［13］。HTK液具有低黏性，并且價(jià)格相對(duì)低廉，最初作為心臟停搏液，之后頻繁用于心臟、腎臟和肝移植中。有研究證實(shí)，UW液與HTK液在動(dòng)物模型和臨床胰腺保存中具有相似結(jié)果［14］。另一項(xiàng)研究報(bào)道表明，若冷缺血時(shí)間＜10小時(shí)，與UW液相比，HTK液保存用于胰島分離的胰腺效果類似，但是當(dāng)延長(zhǎng)低溫保存時(shí)間后，胰島的產(chǎn)量有所下降［15］。Celsior液是一種細(xì)胞外膠體溶液，早期的臨床研究顯示，UW液與Celsior液用于肺、肝及腎的保存沒有明顯差異［16-18］。但 Hubert等［19］報(bào)道了 Celsior液用于人和豬胰島分離前供體原位灌注，研究結(jié)果顯示，UW液原位灌注優(yōu)于Celsior液，原因之一是Celsior液僅在冷藏后4小時(shí)就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹及胰腺水腫。

1.2 雙層保存法：1988年，Kuroda等［20］發(fā)明了雙層法保存胰腺，雙層法含有UW液和全氟化合物，胰腺懸浮在兩層不相融的液體之間。全氟化合物具有親脂性，且氧氣在其中的溶解系數(shù)很高，氧氣能持續(xù)不斷地供給胰腺。供體胰腺運(yùn)輸途中面臨缺血和缺氧這兩個(gè)嚴(yán)重影響胰島分離和移植效果的因素［21］。雙層法可以為保存的胰腺提供氧氣，顯著提高冷缺血時(shí)間較長(zhǎng)的胰腺及邊緣供體的利用率［22］。對(duì)于胰島分離前的胰腺保存，雙層保存法是否優(yōu)于單純UW液保存一直存在爭(zhēng)議。一篇納入14篇文章包含18項(xiàng)臨床研究的Meta分析顯示，與單獨(dú)使用UW液相比，單獨(dú)雙層保存能得到更高的胰島IEQ和更高的移植率，但胰島活性、純度和葡萄糖刺激指數(shù)（glucose stimulation index， GSI）無明顯差別［23］。

1.3 胰腺機(jī)械灌注保存：SCS花費(fèi)較少且易于實(shí)施，但也有局限性。低溫雖然降低了代謝活性，卻不能完全停止代謝活動(dòng)，無氧代謝也會(huì)持續(xù)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)毒素并積累代謝產(chǎn)物［24］。由于是靜態(tài)保存，胰腺內(nèi)代謝毒素不能被清除，ATP持續(xù)被消耗，乳酸積累都會(huì)導(dǎo)致缺血損傷。另外，低溫保存也可能造成胰腺直接凍傷［25］。胰腺體外機(jī)械灌注在一定程度上可以彌補(bǔ)上述不足，并且具有如下優(yōu)勢(shì)：① 實(shí)現(xiàn)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)，持續(xù)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持胰島細(xì)胞代謝。② 清除代謝產(chǎn)物和毒素，這對(duì)邊緣供體尤其重要，因?yàn)楣袷攀篮笃鞴倬璜I(xiàn)（donation after citizen's death， DCD）器官已經(jīng)積累了許多代謝產(chǎn)物和促炎介質(zhì)。機(jī)械灌注將這些毒物清除，可以有效提高移植物功能且減少并發(fā)癥［26-29］。③ 保護(hù)血管和內(nèi)皮，流體通過微血管時(shí)維持血管床有利于內(nèi)皮基因和功能的表達(dá)［30-31］。④ 有利于供體活性評(píng)估，目前，灌注時(shí)血管抵抗已經(jīng)成為一個(gè)關(guān)鍵的活性評(píng)估指標(biāo)［32-33］。⑤ 實(shí)施治療與基因治療，通過加入治療性藥物甚至通過基因修飾來改善保存的器官。多種添加劑在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)中都被證實(shí)可以減少或修復(fù)缺血/再灌注損傷，包括P52抑制劑pifithrin-alpha（抗凋亡制劑）、鈣通道阻斷劑、拉扎洛依（離子介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化抑制劑）、過氧化物歧化酶（自由基酶清除劑）、別嘌醇和血紅素氧化酶 （熱休克蛋白）［24，34］。此外，通過基因修飾可以減輕缺血/再灌注損傷以及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。基因轉(zhuǎn)染通常需要長(zhǎng)時(shí)間器官灌注確保轉(zhuǎn)染有效，并且在正常生理性代謝的基礎(chǔ)上基因轉(zhuǎn)染才更加有效，這正是常溫下機(jī)械灌注的優(yōu)勢(shì)［24，34］。⑥ 遠(yuǎn)程共享和擇期手術(shù)，機(jī)械灌注能延長(zhǎng)保存時(shí)間，實(shí)現(xiàn)器官遠(yuǎn)程分享，使手術(shù)得以更加有計(jì)劃地進(jìn)行，有利于提高總體生存率及降低費(fèi)用［35］。

2 胰島的保存

Edmonton方案最初要求胰島分離后4小時(shí)之內(nèi)移植到受者體內(nèi)［36-37］。如果移植前將胰島進(jìn)行培養(yǎng)，不僅可以完善胰島的質(zhì)控，還可對(duì)受者進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，且在受者到達(dá)診療中心之前保護(hù)好胰島。而多項(xiàng)研究表明，胰島培養(yǎng)和保存時(shí)質(zhì)量和數(shù)量都會(huì)急劇下降［38-41］。移植中心對(duì)胰島移植前胰腺和胰島的保存方法仍需進(jìn)行探索，完善培養(yǎng)和保存方案，以進(jìn)一步提高胰島移植臨床效果。

2.1 胰島培養(yǎng)溫度：研究顯示，在相對(duì)較低的溫度條件下培養(yǎng)胰島，可以有效提高用于移植的胰島保存質(zhì)量。Brandhorst等［42］研究發(fā)現(xiàn)，22℃培養(yǎng)可以改善豬胰島的存活，但與37℃相比，22℃培養(yǎng)會(huì)減少24小時(shí)胰島素釋放量。研究顯示，在37℃培養(yǎng)時(shí)胰島中間壞死情況較為嚴(yán)重，而22～26℃培養(yǎng)能顯著減少胰島中間區(qū)域壞死的發(fā)生［42-43］。Itoh 等［44］也發(fā)現(xiàn)在低氧條件下（1% O2，5% CO2，94% N2），37℃時(shí)細(xì)胞死亡率比22℃時(shí)高。Ono等［45］的研究顯示，與維持在37℃培養(yǎng)相比，將溫度從24℃提高到37℃（24℃培養(yǎng)1～4周后升溫到37℃培養(yǎng)1周）能增加胰島細(xì)胞胰島素釋放率。這些研究結(jié)果均提示胰島培養(yǎng)溫度22～26℃可能優(yōu)于37℃。進(jìn)而Ikemoto等［46］研究發(fā)現(xiàn)，4℃條件下豬胰島的復(fù)蘇率明顯高于37℃和22℃。Ishii等［47］報(bào)道了4℃ UW液中保存胰島，其數(shù)量幾乎與新鮮胰島一致。Itoh等［44］顯示低氧條件下（1% O2， 5% CO2， 94% N2），4℃條件下培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞死亡率明顯低于37℃；鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠接受4℃低氧培養(yǎng)的胰島移植后糖尿病癥狀得到明顯改善，但接受22℃和37℃低氧培養(yǎng)的胰島效果卻治療效果欠佳。Noguchi等［48］和Kin等［40］都發(fā)現(xiàn)與新鮮的胰島相比，22℃和37℃培養(yǎng)后胰島直徑更小，但4℃培養(yǎng)后，胰島直徑和形態(tài)、腺泡細(xì)胞形態(tài)都與正常胰島一致。研究顯示，4℃培養(yǎng)時(shí)需氧量低，且低溫可以抑制細(xì)胞因子/趨化因子的活性，這些可能是4℃條件下培養(yǎng)胰島更具活性的原因［43，45］。因此，后續(xù)的研究應(yīng)該詳盡評(píng)估胰島4℃保存時(shí)對(duì)胰島的保護(hù)作用以及用于移植后的臨床療效。

2.2 培養(yǎng)液中人血清白蛋白 （human serum albumin，HSA）的添加：Connaught Medical Research Laboratories（CMRL）發(fā)明的含0.500%～0.625% HSA培養(yǎng)基已被很多移植中心用于臨床移植胰島的培養(yǎng)［38，48］。通常認(rèn)為添加血清的培養(yǎng)基比單獨(dú)添加HSA的培養(yǎng)基更好，因?yàn)檠逯锌赡芎欣谝葝u活性的成分，而且能夠中和內(nèi)源性胰酶和分離過程中遺留的外源酶［49-50］。當(dāng)用10%的人AB型血清替代0.625%HSA時(shí)，胰島凋亡水平更低，刺激后胰島素分泌水平更高。Kerr-Conte等［51］研究發(fā)現(xiàn)，用2.5%人AB型血清替代0.625% HSA培養(yǎng)胰島時(shí)，胰島活性更高，胰島素含量更多，且胰島刺激指數(shù)更高。Avgoustiniatos等［52］發(fā)現(xiàn)，使用胎牛血清做添加物比用HSA做添加物時(shí)，單位DNA平均耗氧率高27%。但是，胎牛血清作為添加物并不理想，因?yàn)榭赡軙?huì)引入異種遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生異種排斥反應(yīng)。而獲取大量AB型血清用于臨床胰島分離和培養(yǎng)也較難。因此，許多移植中心仍然用HSA作為臨床胰島培養(yǎng)基的添加劑。

近幾年，臨床胰島移植取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，逐漸成為脆性糖尿病和移植后嚴(yán)重糖尿病患者的理想治療手段。提高供體胰腺的保存質(zhì)量用于胰島制備以及提高移植前胰島培養(yǎng)的效果，勢(shì)必將進(jìn)一步提高臨床胰島移植的療效以及擴(kuò)展臨床胰島移植的應(yīng)用范圍。