科羅索酸下調(diào)MMP-2、MMP-9抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移與侵襲

張軍要，梁樹才，朱寶安

科羅索酸下調(diào)MMP-2、MMP-9抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移與侵襲

張軍要，梁樹才，朱寶安

目的 探討科羅索酸對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法 設(shè)定空白組與不同濃度的科羅索酸組(5、10、20 μmol·L-1)，觀察LoVo細(xì)胞與不同濃度科羅索酸作用24 h的劃痕愈合率。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)和Western blot檢測(cè)科羅索酸對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力和MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平。結(jié)果 LoVo細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)5、10、20 μmol·L-1科羅索酸處理24 h后，空白組及用藥各組遷移率分別為(72.01±6.88)%、(71.21±6.05)%、(48.36±5.69)%(與空白組相比P<0.05)及(29.18±5.57)%(與空白組相比P<0.01)；Transwell實(shí)驗(yàn)空白及用藥各組的穿膜細(xì)胞數(shù)依次為316.04±38.25、266.02±21.02、151.13±8.51(與空白組相比P<0.01)和147.68±7.90(與空白組相比P<0.01)。Western blot顯示科羅索酸處理后LoVo細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)。結(jié)論 科羅索酸呈濃度依賴性地抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移與侵襲，其可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

科羅索酸；結(jié)腸癌；MMP-2；MMP-9

科羅索酸(corosolic acid,CRA)是一種從中藥貓人參中提取的五環(huán)三萜酸，也存在于大葉紫薇等多種植物中，起初發(fā)現(xiàn)CRA具有治療肥胖癥和Ⅱ型糖尿病的作用而引起重視，近年來有報(bào)道CRA對(duì)腫瘤細(xì)胞也具有一定的抑制作用。結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，治療以外科手術(shù)為主，但常因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[1]。作者前期的研究發(fā)現(xiàn)CRA可通過抑制STAT3途徑促進(jìn)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡[2]，鑒于STAT3途徑與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，結(jié)合近期有文獻(xiàn)報(bào)道CRA可減少小鼠移植瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，推測(cè)CRA可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力有一定的影響[3]。本研究擬探討不同濃度的CRA對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響以及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞由漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，CRA(批號(hào)：G0549)購(gòu)自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液(批號(hào)：1290220)、胰蛋白酶(批號(hào)：1395511)、胎牛血清(批號(hào)：934481)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；兔抗人β-actin(批號(hào)：4967)、兔抗人MMP-2(批號(hào)：4022)、兔抗人MMP-9一抗(批號(hào)：2270)購(gòu)自美國(guó)Sell Signaling公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Promega公司(批號(hào)：W4021)；Western blot化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：320001)購(gòu)自中國(guó)上海貝博生物；Transwell小室(批號(hào)：3422)購(gòu)自Corning公司；超凈工作臺(tái)(Thermo Scientific公司)。

1.2 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)·mL-1，每孔0.5 mL接種于24孔板；培養(yǎng)24 h后，用10 μL移液槍頭在單層細(xì)胞層上劃“一”字形劃痕，用PBS洗滌3次，分別加入含有0～20 μmol·L-1CRA的無血清培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度，并計(jì)算遷移率。劃痕實(shí)驗(yàn)遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.3 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響 用不含血清的培養(yǎng)液按1∶5的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，取Matrigel稀釋液100 μL置于Transwell小室中，37 ℃靜置1 h待用。LoVo細(xì)胞消化后以5×105個(gè)·mL-1的密度重懸于RPMI-1640無血清培養(yǎng)液中，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室，24孔板下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用棉簽拭去Matrigel以及上室內(nèi)未穿過的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次，400倍顯微鏡下取5個(gè)不同的視野計(jì)算穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)。以穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)反映其侵襲能力。

1.4 Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9的表達(dá) 收集各組LoVo細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度至濃度相同，取等量蛋白樣品與2倍上樣緩沖液等體積混合，SDS-PAGE電泳分離之后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上。5%脫脂奶粉封閉；加入稀釋后的第一抗體(MMP-2、MMP-9一抗稀釋比例1∶1 000；β-actin為1∶100)，4 ℃孵育過夜，TBS洗膜3次，每次10 min；加入1∶5 000稀釋的第二抗體，室溫反應(yīng)1 h；TBS洗膜3次，每次10 min；化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，作用24 h后，空白組的遷移率為(72.01±6.88)%，用藥各組的遷移率依次為(71.21±6.05)%、(48.36±5.69)%(與空白組相比，P<0.05)和(29.18±5.57)%(與空白組相比，P<0.01)，隨著CRA濃度增加，對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的抑制作用逐漸增強(qiáng)，見圖1。

圖1 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響(×40)

2.2 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，空白組每視野的穿膜細(xì)數(shù)為316.04±38.25，用藥各組依次為266.02±21.02、151.13±8.51(與空白組相比，P<0.01)和147.68±7.90(與空白組相比，P<0.01)。隨著CRA濃度增加，對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲力的抑制作用逐步增強(qiáng)。見圖2。

圖2 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)

2.3 CRA對(duì)MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，隨著CRA藥物濃度的升高，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 CRA對(duì)LoVo細(xì)胞MMP-2、MMP-9的影響

3 討論

細(xì)胞間的空隙由蛋白和蛋白聚糖組成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)填充，ECM構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)固定細(xì)胞，限制細(xì)胞的自由移動(dòng)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一類依賴鋅離子的細(xì)胞外蛋白水解酶，能夠水解ECM與基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白，使腫瘤細(xì)胞突破ECM和基底膜的限制向周圍組織浸潤(rùn)，并侵入淋巴管或血管，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其中MMP-2和MMP-9被認(rèn)為是與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移最為直接和重要的MMP。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均呈正相關(guān)[4]，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中Ⅳ型膠原的缺失也與MMP-2和MMP-9的過度表達(dá)有關(guān)[5]。

CRA是從貓人參、大葉紫薇等藥用植物中提取的五環(huán)三萜類化合物，最初因其顯著的降血糖、抗炎作用而引起重視[6]，近年來發(fā)現(xiàn)CRA對(duì)胃癌[7]、肝癌[8]等細(xì)胞均有明顯的抑制作用，Yoo等報(bào)道[9]CRA可抑制小鼠移植瘤瘤體內(nèi)血管和淋巴管的生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)，使得CRA在抗腫瘤方面的作用引起了廣泛的重視。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，CRA對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞亦有明顯的抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的作用[2,10]，其作用途徑與CRA抑制信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的活化有關(guān)。近期有報(bào)道CRA能夠抑制裸鼠移植瘤細(xì)胞向周圍組織的浸潤(rùn)與肺部轉(zhuǎn)移[2]。本研究顯示CRA呈現(xiàn)劑量依賴性地抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移與侵襲，其作用可能與CRA抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

在MMP-2基因的啟動(dòng)子內(nèi)存在具有高度親和力的STAT3結(jié)合位點(diǎn)，活化的STAT3可直接調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)。STAT3與MMP-9的作用途徑目前尚不明確，但有報(bào)道證實(shí)，在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中沉默STAT3基因可使MMP-9的表達(dá)降低[11]。Horlad等[3]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CRA能夠抑制STAT3的活化并抑制腫瘤細(xì)胞向周圍組織的浸潤(rùn)。這與本組前期相似，因此推測(cè)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中，CRA可能通過抑制STAT3的活化下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，CRA下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移與侵襲。CRA具有一定抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等作用，使CRA有可能成為前景廣闊的抗腫瘤藥物，更多的生物功能及其作用途徑有待更進(jìn)一步研究。

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Corosolic Acid Down Regulate the Expression of MMP-2 and MMP-9 and Inhibit the Migration and Invasion of LoVo Cell

ZHANG Jun-yao, LIANG Shu-cai, ZHU Bao-an

(Department of Biochemistry,Luohe Medical College,Luohe 462002, China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of corosolic acid on cell migration and invasion of LoVo cells.MethodsLovo cells were divided into four groups and treated with 0, 5, 10 and 20 μmol·L-1of corosolic acid, and the scratch healing rate were tested when LoVo cells interacted with different concentrations of corosolic acid for 24h. Cell invasion was tested by transwell assay. Expression of MMP-2 and MMP-9 were tested by transwell and western blot.ResultsAfter treated with different concentration of corosolic acid, the healing rate of control and treated groups were (72.01±6.88)%, (71.21±6.05)%, (48.36±5.69)% (compared with control group,P<0.05) and (29.18±5.57)% (compared with control group,P<0.01) respectively. Transwell assay showed that the numbers of invasion cells of control and treated groups were 316.04±38.25, 266.02±21.02, 151.13±8.51 (compared with control group,P<0.01) and 147.68±7.90 (compared with control group,P<0.01). The expression of MMP-2 and MMP-9 showed a decreasing trend.ConclusionCorosolic acid inhibited the migration and invasion of LoVo cell in a dose dependent manner, it might be involved in the down regulation of the expression of MMP-2 and MMP-9.

corosolic acid；colon cancer；MMP-2；MMP-9

1672-688X(2017)01-0011-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.004

河南省基礎(chǔ)與前沿科技計(jì)劃項(xiàng)目(132300410466)

2016-12-09

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，河南漯河 462002

張軍要(1982—)，男，河南許昌人，講師，從事腫瘤信號(hào)通路及抗腫瘤藥物篩選研究。

R735.3;R285.5

A