阿特拉津?qū)谕撩富罴捌湮⑸锒鄻有杂绊懷芯?/h1>

2017-04-01 06:10:22張穎曹博姜昭張修遠(yuǎn)王子懿李瑞璇張晉瑄

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報訂閱 2017年3期 收藏

關(guān)鍵詞：阿特拉脲酶黑土

張穎，曹博，姜昭，張修遠(yuǎn)，王子懿，李瑞璇，張晉瑄

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

阿特拉津?qū)谕撩富罴捌湮⑸锒鄻有杂绊懷芯?/p>

張穎，曹博，姜昭，張修遠(yuǎn)，王子懿，李瑞璇，張晉瑄

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

以黑土為研究對象，采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，研究阿特拉津?qū)谕岭迕?、轉(zhuǎn)化酶、多酚氧化酶影響，采用RAPD技術(shù)分析土壤微生物群落。結(jié)果表明，低濃度（25mg·kg-1）阿特拉津?qū)谕岭迕富钚杂写龠M(jìn)作用，中、高濃度（50～125mg·kg-1）阿特拉津?qū)谕岭迕富钚跃哂幸种谱饔们覞舛仍礁咭种圃矫黠@；阿特拉津抑制土壤轉(zhuǎn)化酶活性，培養(yǎng)結(jié)束時（35 d），抑制作用仍然存在；阿特拉津?qū)Χ喾友趸富钚员憩F(xiàn)為抑制-促進(jìn)-恢復(fù)規(guī)律；阿特拉津輸入改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，濃度越高變化越明顯。

黑土；阿特拉津；微生物群落多樣性；土壤酶；RAPD

阿特拉津（Atrazine），又名莠去津，1952年由瑞士Geigy公司研發(fā)的內(nèi)吸選擇性苗前、苗后封閉除草劑[1]。全球使用量大、使用面積廣。阿特拉津主要通過作用于光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞鏈，使其無法正常進(jìn)行光合作用，破壞雜草細(xì)胞膜。主要應(yīng)用于甘蔗、高粱、玉米及茶園除草，可防護(hù)馬唐、蒼耳、豚草屬等多種一年生禾本科雜草和闊葉雜草[2]。土壤中阿特拉津具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)水溶性、不易分解及較長半衰期等特點(diǎn)，易通過降雨、灌溉及淋溶等過程進(jìn)入地表水和地下水，對土壤、大氣及水體生態(tài)環(huán)境造成污染[3-4]。研究表明，低濃度阿特拉津作為內(nèi)分泌干擾物具有毒性作用[5]。阿特拉津?qū)Νh(huán)境影響已引起關(guān)注[6-7]，使用除草劑影響土壤酶活，改變土壤微生物結(jié)構(gòu)[8]。RAPD技術(shù)操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)，成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)以及土壤群落響應(yīng)重要技術(shù)手段[9]。

目前有關(guān)阿特拉津?qū)谕撩富钚杂绊懠安煌瑵舛葪l件下對土壤微生物群落多樣性變化影響研究相對較少。研究不同濃度阿特拉津?qū)谕镣寥烂富钚砸约昂谕林形⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)影響，可為阿特拉津?qū)谕廖廴居绊懺缙陬A(yù)測提供數(shù)據(jù)支持，為其生態(tài)安全評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

97%阿特拉津購買自Sigma化學(xué)試劑有限公司；采用丙酮溶解阿特拉津配置成5 g·L-1儲備液；其余藥品均為分析純。

1.1.2 供試土壤

黑土樣品采集自黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地試驗(yàn)田長期未施用阿特拉津表層（0～20 cm）土壤。取樣后，自然風(fēng)干，研磨后過2mm篩，備用。土壤基本理化性質(zhì)如下：pH 6.23，有機(jī)質(zhì)30.4 g·kg-1，總氮1.94 g·kg-1，總磷1.56 g·kg-1，陽離子交換量（CEC）20.2 cmol·kg-1，未檢測出阿特拉津。

取若干份貯備干土，每份500 g，向土壤中加入阿特拉津儲備液，使土壤中阿特拉津終濃度分別為：25、50、75、100、125mg·kg-1，并設(shè)置未添加阿特拉津處理作空白對照，每個處理設(shè)置三個平行，加入預(yù)先滅菌蒸餾水調(diào)節(jié)土壤含水率為田間最大持水量60%。分別在第3、7、14、21、28、35天測定土壤酶活性變化。

1.1.3 主要設(shè)備和儀器

萬分之一天平（北京賽多利斯）；氣相色譜儀（日本島津）；PCR儀（北京東勝）；滅菌鍋（上海申安）。

1.2 方法

1.2.1 土壤酶活性測定

土壤脲酶、轉(zhuǎn)化酶和多酚氧化酶均采用比色法測定。土壤脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N毫克數(shù)表示；土壤轉(zhuǎn)化酶活性以24 h后1 g土壤中葡萄糖毫克數(shù)表示；土壤多酚氧化酶活性以3 h后1 g土壤中酚毫克數(shù)表示[10]。

1.2.2 土壤微生物RAPD分析

按照Omega Soil Kit試劑說明書步驟提取第35天土壤DNA樣品。PCR反應(yīng)體系為50μL，其中PCR反應(yīng)體系如下：10×Taq buffer 5μL；d NTP（10 mmol·L-1）1μL；DNA模板1μL；RAPD引物1μL；DNA Taq聚合酶1μL；雙蒸水（dd H2O）至37.5μL。10條RAPD引物序列信息如表1所示。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃預(yù)變性1min，37℃退火1min，72℃延伸1min，設(shè)置40個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BIORAD凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。以空白為對照，記錄處理樣品DNA與RAPD引物擴(kuò)增情況，出現(xiàn)新條帶及消失條帶數(shù)，分別以“a”和“b”表示。參照Nei等研究方法計算DNA序列相似性[11]。

表1 試驗(yàn)RAPD引物序列Table1 RAPD Primers

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0、Excel 2007和Origin 8.0等軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津?qū)ν寥烂赣绊?/p>

2.1.1 阿特拉津?qū)ν寥离迕赣绊?/p>

作為土壤中最主要酶類之一，脲酶可將土壤中有機(jī)物水解為作物可再次利用的二氧化碳和氨，與土壤肥力及土壤中物質(zhì)循環(huán)相關(guān)[12]。阿特拉津?qū)τ谕寥离迕赣绊懭鐖D1所示。在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，土壤脲酶活性表現(xiàn)先升后降趨勢。培養(yǎng)7 d，各處理土壤中脲酶活性最高，分別達(dá)到0.68、0.70、0.67、0.66、0.64、0.61mg·NH3-N·g-1·24 h-1。低濃度（25 mg·kg）處理阿特拉津?qū)τ陔迕妇哂写碳ぷ饔?，整個培養(yǎng)過程中土壤脲酶活性高于空白處理。而中、高濃度處理土壤脲酶活性受抑制。隨著阿特拉津濃度增加表現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)至35 d時，除低濃度（25mg·kg-1）處理外，其余各處理組脲酶活性差異不顯著。

2.1.2 阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶影響

土壤轉(zhuǎn)化酶是土壤中多數(shù)生物必需物質(zhì)。研究表明，土壤轉(zhuǎn)化酶強(qiáng)度是評價土壤生物活性及肥力重要指標(biāo)[13]。不同濃度阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶影響如圖2所示。

圖1 阿特拉津?qū)ν寥离迕赣绊慒ig.1 Effectof atrazineon soilureaseactivity

圖2 阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶影響Fig.2 Effect of atrazine on soil inver tase activity

由圖2可知，在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，空白處理土壤轉(zhuǎn)化酶活性上下浮動但總體變化不明顯。除低濃度處理培養(yǎng)初期土壤轉(zhuǎn)化酶表現(xiàn)一定刺激作用外，各濃度阿特拉津處理與對照組相比，土壤轉(zhuǎn)化酶活性均為抑制作用。在培養(yǎng)3～14 d，土壤轉(zhuǎn)化酶活性明顯下降，隨著阿特拉津濃度升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。

第14天時，與對照相比，不同濃度阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶抑制率分別為，9.49%、12.65%、20.77%、27.14%和35.27%。隨培養(yǎng)時間延長，21～35 d，各污染處理土壤轉(zhuǎn)化酶活性整體呈緩慢下降趨勢，均與對照組差異顯著。

2.1.3 阿特拉津?qū)ν寥蓝喾友趸富钚杂绊?/p>

土壤腐殖質(zhì)中芳香族化合物主要通過土壤中多酚氧化酶氧化成醌，形成大小不等有機(jī)質(zhì)，完成土壤物質(zhì)循環(huán)過程。通過測定多酚氧化酶了解土壤腐殖化情況。阿特拉津?qū)τ谕寥蓝喾友趸赣绊懬闆r如圖3所示。在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，空白處理土壤多酚氧化酶變化不大。培養(yǎng)第3天，阿特拉津?qū)ν寥蓝喾友趸副憩F(xiàn)抑制作用且明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，濃度越高，抑制現(xiàn)象越明顯。阿特拉津污染處理土壤多酚氧化酶活性表現(xiàn)促進(jìn)-恢復(fù)規(guī)律。第35天，包括空白處理，各處理多酚氧化酶活性差異不顯著。

圖3 阿特拉津?qū)ν寥蓝喾友趸赣绊慒ig.3 Effect of atrazine on soil Polyphenoloxidase activity

2.2 阿特拉津?qū)ν寥牢⑸镉绊?/p>

以試劑盒提取土壤微生物基因組DNA為模板，選用10條RAPD引物PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳檢測，引物S8對不同處理土壤DNA擴(kuò)增多態(tài)性電泳圖譜見圖4。由于RAPD采用隨機(jī)引物擴(kuò)增，對微生物群落DNA無選擇性，因此擴(kuò)增條帶數(shù)可間接反映土壤微生物相對豐度，不同處理?xiàng)l帶變化情況見表2。利用RAPD指紋圖譜技術(shù)研究不同濃度阿特拉津?qū)τ谕寥繢NA數(shù)量及結(jié)構(gòu)影響?？瞻滋幚硪员?所示引物隨機(jī)擴(kuò)增，空白對照共擴(kuò)增出94條帶。隨著阿特拉津濃度加大，相對于空白處理消失或增加條帶數(shù)總和逐漸增加。相對照空白處理多樣性數(shù)值分別為44.7%、46.85%、48.9%、48.9%以及50%。DNA相似性系數(shù)結(jié)果如表3所示，隨著阿特拉津濃度增加，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性改變；濃度越高對土壤微生物群落影響越大。

圖4 RAPD擴(kuò)增結(jié)果(S8)Fig.4 RAPD am p lification result

表2 阿特拉津?qū)τ谕寥牢⑸锶郝涠鄻有杂绊慣able 2 E ffect ofatrazine on soilm icrobial diversity

表3 不同土壤樣品微生物群落DNA相似性系數(shù)Table 3 Coefficien tsofm icrobial community DNA sequence sim ilarity of different soil sam p les

3 討論

3.1 阿特拉津?qū)τ谕寥烂富钚杂绊?/p>

土壤酶是土壤新陳代謝主要動力，可表征土壤綜合肥力特征及土壤養(yǎng)分循環(huán)過程，反映土壤微生物活性[14-15]。Zhan等研究可溶性有機(jī)碳對土壤酶活性影響發(fā)現(xiàn)，土壤酶活性與培養(yǎng)時間相關(guān)，不同時間土壤酶活變化趨勢不同[16]。范昆等發(fā)現(xiàn)低濃度1,3-二氯丙烯對土壤脲酶活性表現(xiàn)為抑制-激活作用[12]。鄭景瑤等發(fā)現(xiàn)向黑土中添加濃度為120 g·hm-2氟磺胺草醚可明顯抑制土壤脲酶活性[17]。本試驗(yàn)研究表明，低濃度阿特拉津?qū)ν寥离迕赣写碳ぷ饔?，隨濃度增加，土壤脲酶活性受抑制程度加深。這可能由于土壤中存在各類分解阿特拉津微生物，較低濃度下微生物將阿特拉津分解為結(jié)構(gòu)簡單有機(jī)物并被利用至完全分解。與Sabra等報道低濃度除草劑促進(jìn)土壤脲酶活性，高濃度抑制土壤脲酶活性結(jié)論一致[18]。整個培養(yǎng)過程中，阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶活性均表現(xiàn)抑制作用，且在第35天時，污染處理與對照組轉(zhuǎn)化酶活性差異顯著。與駱愛蘭等50～1 000mg·kg-1氟啶胺對土壤轉(zhuǎn)化酶表現(xiàn)為抑制作用研究結(jié)果一致[13]。此外，本研究表明阿特拉津?qū)ν寥蓝喾友趸副憩F(xiàn)為先抑制后激活后再恢復(fù)規(guī)律。與劉惠君等三嗪類除草劑對土壤酶影響研究結(jié)果一致[19]。

3.2 阿特拉津?qū)τ谕寥牢⑸锶郝銬NA序列及相似性影響

目前，RAPD技術(shù)已成功應(yīng)用于檢測污染物引起并對微生物、植物以及動物造成的DNA損傷和突變。結(jié)果表明，阿特拉津可減少土壤DNA條帶數(shù)而未改變多態(tài)性，這可能是微生物群落結(jié)構(gòu)改變及基因重組造成。研究表明土壤中基因穩(wěn)定性受阿特拉津影響，破壞土壤中微生物DNA結(jié)構(gòu)，減少或阻止PCR反應(yīng)。Waisberg等研究表明，污染物可誘導(dǎo)DNA損傷，改變結(jié)構(gòu)，顯著影響PCR擴(kuò)增效果[20]。本研究表明，高濃度阿特拉津影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳。結(jié)果與Yang等報道有毒污染物可改變DNA穩(wěn)定性，改變RAPD圖譜的結(jié)論一致[19]。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，作為常見除草劑，阿特拉津?qū)τ诤谕撩富钚杂绊戯@著，改變土壤微生物群落組成。在整個培養(yǎng)過程中，25mg·kg-1阿特拉津污染處理可刺激土壤脲酶，而其他濃度表現(xiàn)明顯抑制作用，存在劑量關(guān)系。阿特拉津?qū)ν寥擂D(zhuǎn)化酶活性表現(xiàn)為抑制作用，與對照差異顯著。正常條件下土壤多酚氧化酶相對穩(wěn)定，阿特拉津污染處理土壤多酚氧化酶活性表現(xiàn)抑制-促進(jìn)-恢復(fù)規(guī)律。RAPD結(jié)果表明，阿特拉津進(jìn)入黑土后可抑制土壤微生物群落多樣性，抑制程度與添加量相關(guān)。

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Effect of atrazine on soil enzyme activities and microbial communitystructure in black soil

ZHANG Ying,CAO Bo,JIANG Zhao,ZHANG Xiuyuan,WANG Ziyi,LIRuixuan,ZHANG Jinxuan
(School of Resource and Environmental Science, Northeast AgriculturalUniversity, Harbin 150030, China)

The aim of this work was to evaluate the effect of atrazine on the activity of black soilurease, invertase, polyphenol oxidase by simulated experiments, while soil microbial communities wasdetected by using RAPD technology. The results showed that low concentration of atrazine (25 mg· kg-1) hadsimulative effect on the activity of soil urease. Other concentrations of atrazine (50-125 mg· kg- 1) showedinhibitory effect on the activity of soil urease and the inhibition effect was enhanced with the concentrationincreasing. Atrazine restrained the activity of soil invertase throughout the culture period. Howeverpolyphenol oxidase in black soil showed a pattern of inhibition-activation-recovery. In addition, the structureof soil microbial community was changed by atrazine and the change was enhanced with the increase inatrazine concentration.

black soil;atrazine;m icrobialcommunity diversity;soilenzymes;RAPD

X171.5

A

1005-9369（2017）03-0048-06

時間2017-3-21 14:03:00[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170321.1403.012.htm l

張穎,曹博,姜昭,等.阿特拉津?qū)谕撩富罴捌湮⑸锒鄻有杂绊懷芯縖J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(3):48-53.

ZHANG Ying, CAO Bo, JIANG Zhao, et al. Effect of atrazine on soil enzyme activities and microbial community structure inblack soil[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2017, 48(3): 48-53. (in Chinese with English abstract)

2017-03-01

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項(xiàng)目（2014G0026）；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2016RAXXJ103）

張穎（1972-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橥寥辣Ｗo(hù)與修復(fù)。E-mail:zhangying_neau@163.com

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