應(yīng)用基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)

劉 羽，李兆星，檀碧波，范立僑，趙 群，張 萌，徐志彬，李 勇*

·方法學(xué)研究·

應(yīng)用基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)

劉 羽1，李兆星1，檀碧波1，范立僑1，趙 群1，張 萌2，徐志彬3，李 勇1*

目的 應(yīng)用基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)，并初步探討其功能。方法 選取2011年4月—2012年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院確診為胃腺癌并進行手術(shù)切除者16例為研究對象。術(shù)中取患者胃癌組織及癌旁正常組織，采用基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌組織及癌旁正常組織中的差異蛋白質(zhì)，并應(yīng)用免疫組化染色法驗證篩選出的差異蛋白質(zhì)。結(jié)果 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果顯示，胃癌組織與癌旁正常組織均鑒定了3 000～4 000種蛋白質(zhì)，其中12種蛋白質(zhì)差異顯著，將其與GO數(shù)據(jù)庫進行對比，去除二級節(jié)點中歸類為“細胞組分”的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在“分子功能”和“代謝過程”這兩個節(jié)點中找到了4種可能與胃癌有關(guān)的蛋白質(zhì)，即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-π-1(GST-π-1)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(PK-M2)、P120連環(huán)蛋白(P120-ctn)。免疫組化染色結(jié)果顯示，胃癌組織中GST-π-1、PK-M2、P120-ctn陽性率大于癌旁正常組織，Cu/Zn-SOD陽性率小于癌旁正常組織(P<0.001)，與基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果相符。結(jié)論 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定可篩選出胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)(GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn)，初步分析認為其與胃癌的多種細胞生物學(xué)活動有關(guān)，證實基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定在胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)篩選方面具有明顯的應(yīng)用價值。

胃腫瘤；氣相色譜-質(zhì)譜法；蛋白質(zhì)組學(xué)

劉羽,李兆星,檀碧波,等.應(yīng)用基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(9)：1088-1092.[www.chinagp.net]

LIU Y,LI Z X,TAN B B,et al.Identification and screening of proteins associated with gastric adenocarcinoma by proteomics based on liquid chromatography-mass spectrometry[J].Chinese General Practice，2017，20(9)：1088-1092.

胃癌對人類健康危害重大，胃癌標志物及其生物治療相關(guān)作用靶蛋白是目前研究的熱點[1-3]。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)研究是以研究對象的總蛋白質(zhì)為材料，通過分析、鑒定，對發(fā)揮作用的差異蛋白質(zhì)進行分析，其對揭示腫瘤細胞的功能、生物學(xué)行為以及基因表達調(diào)控機制具有重要價值[4]。本課題組前期已成功進行了一些胃癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究[5-6]；本研究嘗試應(yīng)用色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對胃癌組織直接進行蛋白質(zhì)分離，通過與正常組織比對，尋找差異蛋白質(zhì)作為新的胃癌標志物，以期為胃癌標志物篩選提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 組織標本來源 選取2011年4月—2012年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院確診為胃腺癌并進行手術(shù)切除者16例為研究對象。其中男9例，女7例；年齡51～72歲，平均年齡(59.2±10.6)歲。納入標準：(1)確診為胃癌，手術(shù)切除腫瘤，病理為胃腺癌；(2)術(shù)前未接受過放化療等治療。排除標準：(1)術(shù)后復(fù)發(fā)或合并其他惡性腫瘤者；(2)長期應(yīng)用激素或免疫抑制劑者；(3)不同意參加研究者。術(shù)中取患者胃癌組織及癌旁正常組織各1.0 cm×0.5 cm×1.0 cm。標本一式兩份，一份置于-80 ℃保存用于蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定；另一份以中性甲醛固定，用于免疫組化檢測。

1.1.2 主要試劑與儀器 胰蛋白酶(美國Promega公司)，鹽酸胍(美國Sigma公司)，二硫蘇糖醇(華美生物工程有限公司)，碘乙酰胺(美國EMD Chemicals公司)，乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)，所有抗體及免疫組化試劑盒(美國Santa Cruz公司)，液質(zhì)聯(lián)用儀(LTQ XL型，美國Thermo Fisher Scientific公司)，金屬浴(德國Eppendorf公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備 在研缽上用液氮研磨標本，制成干粉，放入EP管中，-80 ℃冰箱保存。加入100 μl鹽酸胍(6 mol/L)、500 μl Tris-Hcl(50 mmol/L，pH=8.0)，4 ℃下12 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)，取上清液，重復(fù)離心(方法同上)2次；取上清液，放入新的EP管中，取100 μl樣本(盡量不要吸到最上層的油層)，加入1 μl 二硫蘇糖醇，金屬浴上37 ℃加熱30 min；加入5 μl碘乙酰胺，室溫

本研究創(chuàng)新點與不足：

(1)近年來通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究篩選腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)已取得了一定成果，但應(yīng)用基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)的研究較為少見。本研究應(yīng)用基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選出4種胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)——谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-π-1(GST-π-1)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(PK-M2)、P120連環(huán)蛋白(P120-ctn)，為胃癌標志物篩選做出了一定貢獻。

(2)本研究由于技術(shù)復(fù)雜，研究成本較高，因而樣本例數(shù)有限，需進一步擴大研究規(guī)模；另外，本研究所篩選得到的差異蛋白質(zhì)尚需要深入研究探討其在胃癌中的具體功能。

避光放置40 min，加入600 μl 50%丙酮、50%乙醇、0.1%醋酸混合液，-20 ℃放置12 h，4 ℃下12 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)，棄上清液；加入70%乙醇1 ml，4 ℃下12 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)，棄上清液；加入100 μl碳酸氫銨(50 mmol/L)溶解、混勻；加入胰蛋白酶2 μl，4 ℃放置16 h，4 ℃下12 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)；取上清液，放入超濾管，4 ℃下12 000 r/min離心15 min(離心半徑15 cm)，取上清液，濃縮至15 μl，加入15 μl 含有1‰甲酸的水溶液后進入液質(zhì)聯(lián)用儀進行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。

1.2.2 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定 酶解后的蛋白質(zhì)樣品利用LC-MS進行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定。多肽混合物經(jīng)納升液相進行液相分離，分離所用色譜柱為C18反相柱(100 μm×150 mm)，梯度洗脫(0.4 μl/min，流動相A為含有1‰甲酸的純水，流動相B為含有1‰甲酸的純乙腈)，流動相B濃度從0～50%共經(jīng)歷85 min，分離后的混合物經(jīng)電噴霧進入LTQ XL質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜鑒定，其中噴霧電壓為2 kV，加熱毛細管溫度為250 ℃。采用數(shù)據(jù)依賴方式進行二級譜圖生成，一級譜圖掃描范圍為400～2 000 m/z，CID碎裂能量設(shè)為35%，Q值設(shè)為0.25，動態(tài)排除循環(huán)時間設(shè)為30 s，排除2個最高離子。

生成的raw data譜圖利用BioWorks 3.3.1軟件進行分析，比對所用數(shù)據(jù)庫為人類蛋白質(zhì)NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫，母離子偏差設(shè)定為2 Da，子離子偏差設(shè)定為1 Da，胰蛋白酶酶解位點最大值設(shè)為2。固定修飾為半胱氨酸還原烷基化，可變修飾為甲硫氨酸氧化，過濾值設(shè)為Delta CN≥0.100；Xcorr(±1，2，3)=1.9，2.5，3.75；peptide probability≤1e-005，假陽性率控制在1%以內(nèi)。

1.2.3 免疫組化染色 應(yīng)用SP法對胃癌組織與癌旁正常組織進行免疫組化染色，按試劑盒說明書進行操作。在高倍顯微鏡(×400)下每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，由2位病理醫(yī)師分別雙盲閱片進行結(jié)果判斷。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-π-1(glutathione S-transferases-π-1，GST-π-1)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PK-M2)、P120連環(huán)蛋白(P120-catenin，P120-ctn)以細胞膜和/或細胞質(zhì)呈黃褐色為染色陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)錄入。免疫組化染色結(jié)果中胃癌組織與癌旁正常組織蛋白質(zhì)陽性率比較比較采用χ2檢驗。所得到的蛋白質(zhì)通過GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)進行分子功能的注釋。

2 結(jié)果

2.1 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果 胃癌組織與癌旁正常組織均鑒定了3 000～4 000種蛋白質(zhì)，其中12種蛋白質(zhì)差異顯著，并且將其與GO數(shù)據(jù)庫進行對比，去除二級節(jié)點中歸類為“細胞組分”的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在“分子功能”和“代謝過程”這兩個節(jié)點中找到了4種可能與胃癌有關(guān)的蛋白質(zhì)，即GST-π-1、Cu/Zn-SOD、M2-PK、P120-ctn(見表1，胃癌組織與癌旁正常組織差異蛋白質(zhì)的二級譜圖請見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

表1 基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果

Table 1 Proteins probably associated with gastric adenocarcinoma identified by proteomics based on LC-MS

編號蛋白質(zhì)名稱人類蛋白質(zhì)NCBI數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)編號相對分子質(zhì)量等電點蛋白質(zhì)打分覆蓋率(%)表達情況1GST-π-11151445723180.56.6870.2849.30a2Cu/Zn-SOD22573398216361.11.8220.1916.35b3PK-M229532205859962.81.9020.288.00a4P120-ctn29497976165255.60.9510.1855.48a

注：GST-π-1=谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-π-1，Cu/Zn-SOD=銅鋅超氧化物歧化酶，PK-M2=丙酮酸激酶M2，P120-ctn=P120連環(huán)蛋白；表達情況中，a為在胃癌組織高表達，b為在癌旁正常組織高表達

2.2 免疫組化染色結(jié)果 胃癌組織中GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn陽性率分別為75.0%(12/16)、31.3%(5/16)、68.8%(11/16)、68.8%(11/16)，癌旁正常組織中GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn陽性率分別為18.8%(3/16)、68.8%(11/16)、31.3%(5/16)、25.0(4/16)。胃癌組織中GST-π-1、PK-M2、P120-ctn陽性率大于癌旁正常組織(χ2=10.165、4.500、6.149，P=0.001、0.034、0.013)，Cu/Zn-SOD陽性率小于癌旁正常組織(χ2=4.500，P=0.034；見圖1～2)。

注：GST-π-1=谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-π-1，Cu/Zn-SOD=銅鋅超氧化物歧化酶,PK-M2=丙酮酸激酶M2,P120-ctn=P120連環(huán)蛋白

圖1 胃癌組織免疫組化染色結(jié)果(SP法，×200)

Figure 1 Gastric adenocarcinoma tissues stained by immunohistochemistry

圖2 癌旁正常組織組化染色結(jié)果(SP法，×200)

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與既往研究不同，是從研究對象的總蛋白質(zhì)水平出發(fā)，通過分析比較差異蛋白質(zhì)，確定影響腫瘤生物學(xué)功能的重要蛋白質(zhì)，其在研究開始前并不確定研究對象，而是通過篩選鑒定而最終確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，在腫瘤的診治中有良好的應(yīng)用前景[7-8]。LC-MS將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能相結(jié)合，對成分復(fù)雜的混合物仍可精確地進行定量和定性分析，對腫瘤研究具有十分重要的意義。

胃癌是我國常見惡性腫瘤，對其標志物及治療靶蛋白的篩選有重要臨床價值。目前胃癌組織相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，應(yīng)用LC-MS的文獻鮮有報道。本研究應(yīng)用LC-MS對胃癌組織及癌旁正常組織的差異蛋白質(zhì)進行了篩選確定，結(jié)果顯示，胃癌組織與癌旁正常組織均鑒定了3 000～4 000種蛋白質(zhì)，其中12種差異蛋白質(zhì)，并且將其與GO數(shù)據(jù)庫進行對比，去除二級節(jié)點中歸類為“細胞組分”的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在“分子功能”和“代謝過程”這兩個節(jié)點中找到了4種可能與胃癌有關(guān)的蛋白質(zhì)，即GST-π-1、Cu/Zn-SOD、M2-PK、P120-ctn，這些蛋白質(zhì)參與了細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤細胞代謝、細胞氧化損傷、維持細胞穩(wěn)態(tài)、抗腫瘤酶系等細胞生物學(xué)活動，可能參與了腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程。GST-π-1分子量為23 kD，具有代謝有毒化合物、保護細胞免受急性毒性化學(xué)物質(zhì)攻擊、抗突變、抗腫瘤酶系等作用[9-10]，與人類腫瘤關(guān)系密切，其也可維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性，在癌組織表達水平低于正常上皮組織，缺乏GST-π-1功能的正常上皮細胞易受到各種致瘤因素的攻擊。超氧化物歧化酶(SOD)主要有3種類型，即Cu/Zn-SOD、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)，其中Cu/Zn-SOD主要存在于細胞質(zhì)中，是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，通過平衡機體的氧自由基，達到避免因機體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高而引起不良反應(yīng)的目的，在抗衰老、防輻射、抑制腫瘤和癌癥、抗炎、自身免疫治療等方面具有獨特的功能，與腫瘤發(fā)生和進展有關(guān)[11]。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是糖酵解途徑相關(guān)酶，分為PK-M和PK-L兩種同工酶，PK-M又分為PK-M1、PK-M2亞型。研究表明，PK-M2影響腫瘤細胞凋亡，對于腫瘤細胞的增殖起重要作用[12-13]。P120-ctn是位于細胞連接處和細胞核內(nèi)armadillo連環(huán)蛋白家族中的亞家族成員，其通過在細胞膜處與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)相互作用而參與E-cadherin介導(dǎo)的細胞黏附過程[14]。E-cadherin在腫瘤上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用；P120-ctn與E-cadherin形成的鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體表達水平發(fā)生變化時會影響細胞分化、增殖等生物學(xué)行為，還可誘發(fā)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[15]。本研究采用免疫組化染色對鑒定出的蛋白質(zhì)進行驗證，結(jié)果顯示，胃癌組織中GST-π-1、M2-PK、P120-ctn陽性率大于癌旁正常組織，Cu/Zn-SOD陽性率低于癌旁正常組織，與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果相符，說明研究結(jié)果具有較高可信度。

本研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定對于一些極酸、極堿、低豐度、難溶蛋白質(zhì)的檢測仍存在一定難度，因而有許多重要蛋白質(zhì)的信息可能會丟失；其次，蛋白質(zhì)圖譜分析系統(tǒng)及數(shù)據(jù)庫尚不十分成熟，對結(jié)果可能會造成一定影響；同時，本研究尚存在蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定前未進行分離比較、所得數(shù)據(jù)量過大及樣本量較小等缺點，可能影響結(jié)果的準確性?？傊壳皯?yīng)用基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定探尋胃癌標志物尚屬于臨床前研究，仍需大量臨床試驗加以驗證。

綜上所述，本研究應(yīng)用基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定篩選出了與胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)-GST-π-1、Cu/Zn-SOD、PK-M2、P120-ctn，初步分析認為其與胃癌的多種細胞生物學(xué)活動有關(guān)，證實基于LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定在胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)篩選方面具有明顯的應(yīng)用價值。但本研究所得為初步結(jié)果，相關(guān)蛋白質(zhì)的具體功能還有待深入研究。

作者貢獻：劉羽進行研究設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責(zé)；李兆星、檀碧波、范立僑、趙群、張萌、徐志彬進行研究實施、評估、資料收集；李勇進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Identification and Screening of Proteins Associated with Gastric Adenocarcinoma by Proteomics Based on Liquid Chromatography-mass Spectrometry

LIUYu1,LIZhao-xing1,TANBi-bo1,FANLi-qiao1,ZHAOQun1,ZHANGMeng2,XUZhi-bin3,LIYong1*

1.TheThirdDepartmentofGeneralSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China3.DepartmentofEndoscopy,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

*Correspondingauthor:LIYong,Professor;E-mail:li_yong_hbth@126.com

Objective To identify and screen the proteins associated with gastric adenocarcinoma by proteomics based on liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS),and to explore the functions of these proteins.Methods Sixteen consecutive patients diagnosed as gastric adenocarcinoma and treated with surgery in Fourth Hospital of Hebei Medical University from April 2011 to September 2012 were selected.The differentially expressed proteins in human gastric adenocarcinoma tissues and adjacent normal tissues taken intraoperatively were identified and screened by proteomics based on LC-MS,and then tested by immunohistochemistry.Results As the results of proteomics based on LC-MS showed,3 000-4 000 proteins were identified in gastric adenocarcinoma tissues and adjacent normal tissues,including 12 significantly differentially expressed proteins.The results were compared with the relative data in GO database.Of the second-level nodes,the structural proteins classified as cellular component were ruled out,and in nodes of "molecular function" and "metabolic process",4 proteins probably associated with gastric adenocarcinoma were selected,which included glutathione S-transferase-π-1(GST-π-1),Cu/Zn superoxide dismutase(Cu/Zn-SOD),pyruvate kinase M2(PK-M2),P120-catenin(P120-ctn).Results of immunohistochemistry revealed that positive rates of GST-π-1,PK-M2,and P120-ctn were higher in gastric adenocarcinoma tissues than in adjacent normal tissues(P<0.001),whereas positive rates of Cu/Zn-SOD were lower in gastric adenocarcinoma tissues than in adjacent normal tissues(P<0.001),which were in accordance with proteomics based on LC-MS.Conclusion Proteins associated with gastric adenocarcinoma(GST-π-1,Cu/Zn-SOD,PK-M2,and P120-ctn) identified with proteomics based on LC-MS,are considered to be related to the multiple cell biological activities of gastric adenocarcinoma via preliminary analysis,which suggests that it is valuable to identify gastric adenocarcinoma associated proteins with proteomics based on LC-MS.

Stomach neoplasms;Gas chromatography-mass spectrometry;Proteomics

國家自然科學(xué)基金資助項目(81372580)；河北省科技支撐項目(11276103D-26)；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目(20160168)

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.09.013

2016-09-08；

2016-12-30)

1.050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科

2.050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科

3.050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)鏡室

*通信作者：李勇，教授；E-mail：li_yong_hbth@126.com