五指毛桃與黃芪提取物對免疫抑制小鼠細胞免疫的影響

張志超 劉江紅 潘遠安

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518000

五指毛桃與黃芪提取物對免疫抑制小鼠細胞免疫的影響

張志超 劉江紅 潘遠安

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518000

目的：探討五指毛桃與黃芪提取物對免疫抑制小鼠細胞免疫的影響。方法：取100只小鼠進行研究，隨機分為正常對照組、陽性對照組(20mg/kg左旋咪唑)、五指毛桃提取物組、黃芪提取物組、環(huán)磷酰胺模型組，每組20只，經(jīng)腹部注射環(huán)磷酰胺制備免疫功能低下小鼠模型，經(jīng)連續(xù)灌胃給藥2周后，對各組小鼠的T淋巴細胞亞群變化、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL-1及INF-y進行觀察。結(jié)果：黃芪提取物組與五指毛桃組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)明顯高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；黃芪提取物組與五指毛桃組的T細胞亞群數(shù)量及IL-1與INF-y含量顯著較環(huán)磷酰胺組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：五指毛桃與黃其提取物均能提高免疫抑制小鼠細胞免疫功能。

黃芪；五指毛桃；細胞免疫；免疫抑制

黃芪為常用補氣藥物，具有悠久的應用歷史。黃芪單體具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1]。五指毛桃被稱為南芪，其為常用的黃芪替代藥物。有學者認為[2]，五指毛桃的補氣扶正作用與黃芪相近，適合南方人體質(zhì)。但是對于五指毛桃的免疫調(diào)節(jié)機制尚無確切定論。本研究對免疫抑制小鼠分別應用黃芪提取物與五指毛桃提取物，觀察其免疫指標變化。

1 儀器與材料

1.1 試驗動物 選擇健康昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22g。中山大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(粵)2013-0001。

1.2 材料 黃芪與五指毛桃干燥藥材(深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科提供)；環(huán)磷酰胺(國藥準字H44020383，廣州白云山光華制藥股份有限公司)；鹽酸左旋咪唑片(國藥準字H44020759，廣東華南藥業(yè)集團有限公司)；小鼠白細胞介素1β(IL-1)、Hyclone改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、FT-TC-抗小鼠CD3、PE/Cy5-小鼠CD4、PE-抗小鼠CD8、II型干擾素(INF-y)ELISA試劑等試劑均購自深圳達科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 AF2-0502-U超純水機(艾科浦公司)；Epics XL流式細胞儀(美國貝克曼COULTER公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

2 方法

2.1 藥物的制備 取黃芪與五指毛桃干燥藥材300g，以10倍量蒸餾水浸泡1.5h，加熱煮沸1.5h，濾取藥液；再加8倍量水，煮沸1h，第三次煮沸0.5h。合并三次濾物，將藥物濃縮為4g生藥/mL。

2.2 模型的制備與分組 100只小鼠隨機分為正常對照組、陽性對照組、環(huán)磷酰胺組、五指毛桃提取物組與黃芪提取物組，每組20只。除對照組外，每組均于腹部注射環(huán)磷酰胺，40～60mg/kg，連續(xù)1周，制備免疫抑制小鼠。五指毛桃組與黃芪組均給予中等且相同劑量，以4.4g/kg給小鼠灌胃，陽性對照組給予20mg/kg左旋咪唑，正常對照組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)用藥2周。

2.3 評價指標

2.3.1 脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù) 第14天給藥24h后，將所有小鼠摘眼球放血脫頸椎處死，稱量體重。取出脾臟與胸腺，采取4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，胸腺或脾臟質(zhì)量與小鼠體重之比作為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)。

2.3.2 T淋巴細胞亞群比例測定 制備脾細胞懸液，細胞濃度1×107個/mL，100μL細胞混懸液+FTTC-抗小鼠CD3 1μL+PE/Cy5-小鼠CD4 1.25μL+PE-抗小鼠CD8 1.25μL。洗滌后離心，取沉淀細胞，加入500μLPBS，以流式細胞儀進行T細胞亞群數(shù)量檢測。

2.3.3 血清IL-1與INF-y含量測定 取各組小鼠眼眶靜脈血，靜置3h，使血清析出，以1500r/離心10min，取血清。根據(jù)試劑盒說明書對IL-1與INF-y含量進行檢測。

2.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，用均數(shù)±標準差表示，計量資料以t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù) 黃芪提取物組與五指毛桃組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)明顯高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

3.2 T細胞亞群比較 黃芪提取物組與五指毛桃組的T細胞亞群數(shù)量顯著較環(huán)磷酰胺組高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

3.3 IL-1與INF-y含量比較 五指毛桃提取物組與黃芪提取物組的IL-1與INF-y含量均高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 各組小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)比較±s)

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

表2 各組小鼠的T細胞亞群比較 ±s)

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

表3 各組小鼠的IL-1與INF-y水平比較

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

4 討論

免疫系統(tǒng)是機體內(nèi)外環(huán)境變化的適應及反應系統(tǒng)，與機體老化過程呈密切相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)[3]，免疫功能下降會加速機體衰老，衰老過程中，免疫功能會逐漸衰退，以細胞免疫功能下降最為明顯。因此，提高機體免疫功能，延緩人體衰老，成為許多學者研究的主要方向。

研究表明[4]免疫老化核心與淋巴細胞數(shù)量減少、分泌功能下降、淋巴細胞凋亡異常等相關(guān)。而免疫細胞的細胞及分子水平具有可調(diào)控性，因此，調(diào)節(jié)淋巴細胞活性、增強細胞免疫功能，重建衰老過程的淋巴細胞免疫穩(wěn)態(tài)，可能成為延緩衰老的有效方法[5]。中藥具有多靶點、多途徑、多器官調(diào)控免疫機制效果，將其作為免疫調(diào)節(jié)劑具有一定優(yōu)勢。黃芪是最常用的扶正補益中藥，經(jīng)藥理研究證實[6]，黃芪具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用。五指毛桃是華南地區(qū)常用藥物，其作用與黃芪相近。研究發(fā)現(xiàn)[7]，五指毛桃可通過提高機體抗氧化能力而產(chǎn)生抗衰老效果，也具有免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究通過對小鼠注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠，環(huán)磷酰胺是細胞毒性烷化劑，可抑制DNA合成，本研究除對照組外所有小鼠經(jīng)注射環(huán)磷酰胺后均造模成功。脾臟與胸腺為外周免疫器官，機體免疫分化與增值，均會對脾臟及胸腺質(zhì)量造成一定影響，通過胸腺與脾臟指數(shù)可判斷機體免疫狀態(tài)[8]。研究顯示，五指毛桃提取物組與黃芪提取物組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)明顯較環(huán)磷酰胺組高(P<0.05)，提示，五指毛桃與黃芪均有免疫增強作用，可保護免疫器官。

巨噬細胞可分泌IL-1，而IL-1以自分泌或旁分泌形式作用于巨噬細胞，參與固有免疫應答過程[9]。對血清IL-1含量進行檢測，可有效反映機體免疫功能狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃提取物組與黃芪提取物組的IL-1水平明顯較環(huán)磷酰胺組高(P<0.05)，可見，五指毛桃與黃芪提取物能對巨噬細胞分泌功能產(chǎn)生影響，也能增強機體固有免疫應答能力。

T淋巴細胞亞群細胞包括CD4+與CD8+，其中CD4+可通過激活自身分泌趨化因子及細胞因子，從而增強機體免疫功能；CD8+可直接殺傷靶抗原，作用于腫瘤細胞與感染細胞，是機體早期免疫反應細胞之一[10]。INF-y為Th1淋巴細胞亞群的細胞，可促進CD8+T淋巴細胞增殖與分化，提高機體免疫功能。研究顯示，五指毛桃與黃芪提取物組的INF-y與CD8+、CD4+、CD4+/CD8+均高于環(huán)磷酰胺組(P<0.05)，表明五指毛桃與黃芪提取物可增強小鼠T淋巴細胞亞群數(shù)量，從而恢復機體免疫平衡。

綜合上述，黃芪與五指毛桃提取物均可明顯提高小鼠免疫功能，但是對于五指毛桃是否在免疫調(diào)節(jié)方面能替代黃芪，尚需要更多研究進一步探討。

[1]張文君,程衛(wèi)東,李緯，等.紅芪替換玉屏風散中黃芪對SAMP8小鼠抗免疫老化作用的比較[J].中成藥,2016,38(4):920-924.

[2] 楊杰,衛(wèi)東鋒,王文瀟，等.五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞氧化損傷的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(1):52-55.

[3] 趙曉峰,何海根,章建萍，等.黃芪對免疫功能低下小鼠免疫功能的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2012,36(6):749-751.

[4] 吳驍,王光,李彥，等.黃芪注射液對D-半乳糖所致衰老小鼠的免疫、衰老和血脂指標的影響[J].實驗動物科學,2011,28(6):7-9.

[5] 張李峰,程衛(wèi)東,桂曼曼，等.紅芪替換玉屏風口服液中的黃芪后對免疫抑制小鼠細胞免疫作用的比較研究[J].中藥材,2012,35(2):269-273.

[6] 王墅塾,王梓楠,趙自明，等.黃芪注射液對免疫功能低下小鼠脾淋巴細胞的影響[J].動物醫(yī)學進展,2014,35(4):63-66.

[7] 劉文啟,嚴華,李韋，等.五指毛桃生藥學研究[J].中草藥,2014,45(7):1011-1015.

[8] 周建輝,張耀鋒.研究五指毛桃藥理作用并與黃芪的益氣作用相對比[J].中醫(yī)臨床研究,2015,7(33):145-147.

[9] 鄭蓉蓉,軋霽,王文婧，等.五指毛桃的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2013,38(21):3696-3701.

[10] 馮勁立,李想.五指毛桃對阿爾茨海默病小鼠學習記憶功能及過氧化損傷的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2015,35(9):31-32,69.

龍華新區(qū)科技計劃項目(NO：20160523A1030149)。

張志超(1980-)，男，漢族，本科，主管藥師，研究方向為藥學。 E-mail:390605928@qq.com

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1007-8517(2017)05-0058-02

2016-12-22 編輯：程鵬飛)