原發(fā)性肝癌表皮生長(zhǎng)因子受體突變的研究

于淼 邱李輝 熊偉 蘇慧娟 葉綠

原發(fā)性肝癌表皮生長(zhǎng)因子受體突變的研究

于淼1邱李輝1熊偉1蘇慧娟1葉綠2★

目的對(duì)原發(fā)性肝癌患者EGFR基因進(jìn)行檢測(cè)，分析EGFR基因突變與原發(fā)性肝癌及患者年齡組成的關(guān)系。方法對(duì)2507例確診原發(fā)性肝癌的石蠟包埋組織樣本用PCR擴(kuò)增法和雙向測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)。結(jié)果2507例患者僅檢測(cè)出620例（24.74%）EGFR基因20外顯子同義突變Q787Q（2361G＞A）和263例（10.49%）19內(nèi)含子點(diǎn)突變（2284?60T＞C）；EGFR基因突變與患者性別、病理類型無(wú)關(guān)（P＞0.05），與患者的年齡段組成明顯相關(guān)（P＜0.05），且基于年齡段的分布，20外顯子突變與19內(nèi)含子突變呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論本研究中未發(fā)現(xiàn)EGFR基因熱點(diǎn)突變。同義突變位點(diǎn)Q787Q尚存在進(jìn)一步需要被證實(shí)的功能。20外顯子突變和19內(nèi)含子突變與患者年齡分布有明顯相關(guān)性，可為原發(fā)性肝癌患者提供更具體的個(gè)體化治療方案。

原發(fā)性肝癌；表皮生長(zhǎng)因子受體；基因突變

原發(fā)性肝癌（primary hepatocarcinoma，PHC）是指源于肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，包括膽管囊腺癌、肝細(xì)胞?膽管細(xì)胞混合癌及一些少見(jiàn)類型，其中常見(jiàn)類型為肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌，是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)肝癌新增病例占全世界總數(shù)的50.5%，死亡病例占全世界總數(shù)的51.3%［1］。原發(fā)性肝癌是一種多條染色體上多個(gè)基因變化的復(fù)合基因病，基因改變的累加效應(yīng)直接促成了肝癌的發(fā)生［2］。其中許多關(guān)鍵基因（ras、p53、BRCA2等）的突變、缺失或過(guò)表達(dá)均與肝癌的發(fā)生高度相關(guān)［3］。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor re?cepter，EGFR）是一種受體型酪氨酸激酶，是相對(duì)分子質(zhì)量為170×103的跨膜糖蛋白［4］。研究表明，在多種惡性腫瘤中均檢測(cè)到EGFR過(guò)度表達(dá)或突變，如非小型細(xì)胞肺癌、頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌、食管癌等［5?8］。近年來(lái)研究表明，肝癌中EGF及EGFR也存在過(guò)度表達(dá)或突變，這可能與肝癌的形成、侵襲性生長(zhǎng)、臨床特征有密切關(guān)聯(lián)，并且在低分化的肝癌患者中，EGFR過(guò)表達(dá)影響到患者預(yù)后的恢復(fù)［9?11］。我國(guó)有學(xué)者認(rèn)為EGFR和EGFRvIII高表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌變的重要因素，可以作為評(píng)價(jià)肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)［12?14］；但是有關(guān)EGFR與我國(guó)原發(fā)性肝癌人群關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，且不全面。本研究擬對(duì)2 507例原發(fā)性肝癌患者EGFR基因的突變情況進(jìn)行檢測(cè)，初步分析EGFR基因突變情況與患者臨床特征之間的關(guān)系，并探討EGFR基因突變與患者年齡組成的關(guān)系，為原發(fā)性肝癌的分子靶向治療提供基礎(chǔ)性參考依據(jù)和臨床指導(dǎo)，希望找到一條原發(fā)性肝癌分子靶向治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年3月至2014年7月來(lái)自全國(guó)各醫(yī)院病理科經(jīng)手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌石蠟包埋組織樣本2 507例，顯微鏡下證實(shí)腫瘤細(xì)胞完整。其中男性2 153例，女性354例；年齡19～87歲，中位年齡52歲；病理類型：2 307例肝細(xì)胞癌，179例肝內(nèi)膽管癌，21例肝膽混合癌。病理學(xué)分類按照WHO標(biāo)準(zhǔn)［1］。所有患者手術(shù)前均未接受過(guò)放療化療及靶向藥物治療。樣本均在RNAlater（QIAGEN，德國(guó)）的凍存管中4℃保存，并于2個(gè)工作日內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 提取基因組DNA

應(yīng)用石蠟切片DNA提取試劑盒（FFPE gDNA miniPREP KIT，BIOMIGA，美國(guó)）進(jìn)行DNA提取。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定濃度與純度并稀釋，要求A260/A280大于1.8且小于2.0，原液濃度為200 ng/μL，置于?20℃冰箱中保存?；蚪MDNA工作液稀釋至濃度60 ng/ μL，置于4℃保存。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序

采用PCR擴(kuò)增法和測(cè)序法分析原發(fā)性肝癌患者石蠟包埋組織中EGFR基因突變情況。根據(jù)NCBI發(fā)布的EGFR全基因組序列（NM?005228）和mRNA序列，用Oligo軟件在EGFR第18、19、20、21外顯子兩側(cè)各設(shè)計(jì)1對(duì)PCR引物。序列如下：

第18外顯子：上游引物：5′?CAGGTGATTCGTG?GAGCCC?3′，

下游引物：5′?TAGGATGTGGAGATGAGCAG?3′。第19外顯子：上游引物：5′?ACTTCACAGCCCT?GCGTAAAC?3′，

下游引物：5′?ATGGGACAGGCACTGATTTGT?3′。第20外顯子：上游引物：5′?CAGCAGCGGGTTA?CATCTTC?3′，

下游引物：5′?GCAGCCTGCTCCCTGGTGTC?3′。

第21外顯子：上游引物：5′?GCTTGGTGCACCGC?GACCTG?3′，

下游引物：5′?CGCACCCAGCAGTTTGGCGA?3′。

PCR反應(yīng)體系組成為：水33 μL，10×PCR buf?fer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，60 ng/μL DNA模板4 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。反應(yīng)條件均為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保溫。所有產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，純化后的產(chǎn)物從正反雙鏈測(cè)序分析EGFR基因突變情況。測(cè)序儀器為ABI PRISM3730（USA），測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0和ORIGION 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，應(yīng)用列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)分析EGFR基因突變與患者性別、年齡和病理類型之間的關(guān)系，必要時(shí)用Fisher’s精確概率法分析，當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異顯著；根據(jù)不同年齡組成與EGFR基因突變率的分布散點(diǎn)圖，應(yīng)用回歸分析求出其擬合曲線，并建立回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變情況

EGFR基因的突變特點(diǎn)及類型見(jiàn)表1。2 507例患者EGFR基因18、19、21外顯子未檢測(cè)到任何突變或缺失；檢測(cè)出620例（24.74%）20外顯子突變，突變類型為同義突變Q787Q（2361G＞A）；263例（10.49%）檢測(cè)到19內(nèi)含子點(diǎn)突變（2284?60T＞C）；發(fā)生19內(nèi)含子突變的患者同時(shí)發(fā)生20外顯子的突變，即雙突變（10.49%）。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 EGFR基因突變的分布特點(diǎn)及類型Table 1 The type and distribution of EGFR gene mutation

表2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系Table 2 Correlation of EGFR mutation to clinical characteristics of PHC

2.2 EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關(guān)系

EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關(guān)系見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，在2 507例病例中，男性患者2 153例，EGFR基因突變率為24.66%，女性患者254例，EGFR基因突變率為 25.14%；576例（24.97%）肝細(xì)胞癌、42例（23.46%）肝內(nèi)膽管癌和2例（9.52%）肝膽混合癌發(fā)生EGFR基因突變。EGFR基因的突變與性別、病理類型均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 EGFR基因突變例數(shù)與肝細(xì)胞癌患者年齡組成的關(guān)系

EGFR基因的突變例數(shù)與肝細(xì)胞癌患者年齡組成之間的關(guān)系如圖2示。EGFR基因突變例數(shù)與肝細(xì)胞癌患者年齡段呈拋物線關(guān)系，年齡50～59歲的患者突變數(shù)量最多，方差檢驗(yàn)有顯著相關(guān)?；貧w分析顯示：回歸系數(shù)R=0.958，決定系數(shù)R2=0.918，校正決定系數(shù)R2=0.917，顯著性檢驗(yàn)P＜0.000 1，回歸方程：y=-840.413+38.883x-0.363x2（y為20外顯子突變率，x為肝細(xì)胞癌患者平均年齡）。

2.4 EGFR基因20外顯子和19內(nèi)含子突變率與肝細(xì)胞癌患者年齡組成之間的關(guān)系

圖1 EGFR基因突變的測(cè)序結(jié)果Figure 1 Sequencing results of mutations in the EGFR gene

圖2 EGFR基因突變例數(shù)與肝細(xì)胞癌患者年齡之間的關(guān)系Figure 2 Correlation of number of EGFR mutation to age groups of patients of PHC

圖3 EGFR基因的突變情況與肝細(xì)胞癌患者年齡組成之間的關(guān)系Figure 3 Correlation of EGFR mutation to age groups of patients of PHC

EGFR基因的突變情況與肝細(xì)胞癌患者年齡組成之間的關(guān)系如圖3和表3示。第20外顯子突變率與突變患者年齡段呈拋物線關(guān)系，年齡50～59歲的突變患者比例最高，方差檢驗(yàn)有顯著相關(guān)。回歸分析顯示：回歸系數(shù)R=0.958，決定系數(shù)R2=0.918，校正決定系數(shù)R2=0.916，顯著性檢驗(yàn)P＜0.000 1，回歸方程：y=-135.507+6.27x-0.059x2（y為20外顯子突變率，x為突變患者平均年齡）；19內(nèi)含子突變率與突變患者年齡段也呈拋物線關(guān)系，年齡50～59歲的突變患者比例同樣也最高，方差檢驗(yàn)有顯著相關(guān)?；貧w分析顯示：回歸系數(shù)R= 0.917，決定系數(shù) R2=0.841，校正決定系數(shù) R2= 0.838，顯著性檢驗(yàn) P＜0.000 1，回歸方程：y=-147.435+6.75x-0.063x2（y為19內(nèi)含子突變率，x為突變患者平均年齡）。進(jìn)一步分析顯示，基于突變患者年齡段分布，EGFR基因20外顯子突變率與19內(nèi)含子突變率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

2.5 EGFR基因突變與患者病理類型的關(guān)系

EGFR基因突變與病理類型的關(guān)系見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，在2 307例肝細(xì)胞癌病例中，男性為500例（24.95%），女性為76例（25.08%）；在179例肝內(nèi)膽管癌和21例肝膽混合癌病例中，男性分別為32例（23.70%）、2例（9.52%），女性分別為10例（22.73%）、0例發(fā)生發(fā)生EGFR基因突變。EGFR基因的突變與不同的病理類型均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 EGFR基因20外顯子突變與19內(nèi)含子突變的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between mutants of exon 20 and intron 19 of EGFR

表4 EGFR基因突變與病理類型的關(guān)系Table 4 Correlation of EGFR mutation to clinical characteristics of PHC

3 討論

伴隨著慢性肝炎、肝硬化、肥胖發(fā)生率及飲食習(xí)慣不科學(xué)等現(xiàn)象的發(fā)生日趨常態(tài)，近年來(lái)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率逐年升高。由于其分子發(fā)病機(jī)制具有復(fù)雜性、異質(zhì)性、累積性等特點(diǎn)［2］，并且不同的致癌機(jī)制在PHC中均發(fā)生不同程度的改變，這為PHC分子靶向治療提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)［15］。目前應(yīng)用在臨床上的肝癌分子靶向治療中較為成熟有效的也僅限于針對(duì)VEGFR2等靶標(biāo)使用的索拉非尼藥物，并沒(méi)有像其他癌癥（肺癌、乳腺癌等）那樣出現(xiàn)跨越式的進(jìn)步。關(guān)于EGFR基因突變情況在肝癌中的分子作用機(jī)制尚不明確，且與原發(fā)性肝癌關(guān)系的報(bào)道也極其有限，更多的研究聚焦在肝癌中EGFR基因的表達(dá)水平。可見(jiàn)，進(jìn)一步探究肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，為肝癌的分子靶向治療及個(gè)體化用藥方案制定建立臨床基礎(chǔ)。

EGFR基因共28個(gè)外顯子，其中第18～21外顯子是編碼酪氨酸激酶的區(qū)域，EGFR基因發(fā)生最常見(jiàn)的突變是第19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點(diǎn)突變，被認(rèn)為是激活突變［5］。以往大量的臨床研究表明，選用EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療發(fā)生該活化突變的患者敏感性增強(qiáng)，生存率顯著提高，而未發(fā)生突變的患者多數(shù)不會(huì)從EGFR靶向治療藥物中獲益。本研究結(jié)果表明，2 507例患者中未出現(xiàn)EGFR基因的熱點(diǎn)突變，僅檢測(cè)到620例（24.74%）第20外顯子發(fā)生同義突變Q787Q（2361G＞A），國(guó)外學(xué)者在原發(fā)性肝癌EGFR基因突變的研究中也得出相似的結(jié)果［16?17］。

本研究雖未發(fā)現(xiàn)EGFR基因上存在熱點(diǎn)突變，但我們發(fā)現(xiàn)高比例的20外顯子同義突變Q787Q（rs1050171）。關(guān)于Q787Q位點(diǎn)突變的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，大量的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，56%宮頸腺癌中EGFR基因外顯子20存在同義突變（Q787Q）［18］，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中Q787Q突變率為56.3%［19］。盡管同義突變并未引起氨基酸的改變，但“沉默突變”仍可能通過(guò)改變EGFR基因的拼接、mRNA的穩(wěn)定性，一定程度地影響蛋白質(zhì)的最終表達(dá)。已有研究顯示，EGFR基因2073位點(diǎn)的同義突變導(dǎo)致了EGFR基因轉(zhuǎn)錄的mRNA縮短，致使EGFR三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［20］；Q508Q同義突變引起TGFBR2基因異常拼接，導(dǎo)致蛋白編碼提前終止［21］。Tagauchi等［19］研究結(jié)果表明，含有Q787Q突變型頭頸部癌細(xì)胞系較野生型癌細(xì)胞系對(duì)吉非替尼更為敏感（P＜0.05），預(yù)示該位點(diǎn)可能是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌分子靶向治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)Q787Q突變的患者進(jìn)行吉非替尼治療后，13%的患者病情獲得明顯緩解［22］。由此可見(jiàn)，同義突變位點(diǎn)Q787Q尚存在進(jìn)一步需要被證實(shí)的功能，這種功能可能會(huì)豐富原發(fā)性肝癌的靶向治療及發(fā)生機(jī)制的研究。

值得一提的是，我們通過(guò)回歸分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變率與肝細(xì)胞癌患者的年齡段組成明顯相關(guān)（P＜0.05）。50～59歲年齡段的患者EGFR基因20外顯子和19內(nèi)含子突變率均最高。肝內(nèi)膽管癌和肝膽混合癌病例因數(shù)量少，無(wú)法按照年齡段組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。鑒于此，依據(jù)EGFR基因突變規(guī)律為原發(fā)性肝癌患者提供更具體的個(gè)體化治療方案。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，攜帶2284?60T＞C突變的患者100%發(fā)生2361G＞A突變，而攜帶 2361G＞A突變的患者中僅有約 50%發(fā)生2284?60T＞C突變。2284?60T＞C與2361G＞A的關(guān)聯(lián)及原發(fā)性肝癌EGFR基因發(fā)生雙突變后相關(guān)的生物學(xué)事件，將是我們今后深入研究的新方向。

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Analysis of EGFR mutation status in primary hepatocarcinoma patients

YU Miao1,QIU Lihui1,XIONG Wei1,SU Huijuan1,YE Lv2★
(1.Shanghai DaAn Center for Medical Laboratory,Shanghai,China,200120;2.GuangZhou DaAn Clinical Lab?oratory Center Pathology Department,Guangzhou,Guangdong,China,510080)

ObjectiveTo detect the EGFR mutations(exon18,19,20,21)in primary hepatocarcino?ma(PHC)tissue,and to study the correlation between the EGFR mutations and the ages and clinical features of the patients with the aim of supporting the development of new molecular targeting therapy for PHC patients.MethodsParaffin embedded tissues from 2 507 cases were collected,and EGFR mutations were detected us?ing PCR and bidirectional sequencing.ResultsOut of the 2 507 cases of PHC,there were 620 PHC pa?tients carrying a silent mutation,which showed a G?to?A transition at nucleotide 2361 in exon 20 of the gene. Furthermore,263 PHC patients(10.49%)were found to be carrying the mutation 2284?60T＞C in intron 19 The EGFR mutations 2361G＞C and 2284?60 were not related to sex or pathology(P＞0.05),but were related to the age of the PHC patients(P＜0.05).In addition,a significant positive correlation was found between the mutation rate of exon 20 and intron 19(P＜0.05)based on the ages of the PHC patients.ConclusionThere were no hot mutations found in the EGFR gene.The features of the EGFR 2361G＞C mutation need to be analyzed fur?ther.Investigation into the characteristics of exon 20 and intron 19 may provide avenues for more individualized therapy in PHC.

Primary hepatocarcinoma(PHC);Epidermal growth factor recepter(EGFR);Gene muta?tion

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★通訊作者：葉綠，E?mail：yelv@yunkanghealth.com