表達(dá)PEDF的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移

陳巧玲，白亦光，肖東琴，劉 康，馮 剛*

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科；3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

表達(dá)PEDF的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移

陳巧玲1，白亦光2，肖東琴3，劉 康3，馮 剛3*

(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院骨科；3川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

目的 探討攜帶色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)基因的腺病毒轉(zhuǎn)染胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PMSCs)后對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。 方法 取足月產(chǎn)胎兒的胎盤組織，分離、培養(yǎng)PMSCs，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)記。用攜帶PEDF基因的腺病毒(Ad-PEDF)轉(zhuǎn)染PMSCs，并用Western blot和ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染了Ad-PEDF的PMSCs細(xì)胞(PMSCs-PEDF)培養(yǎng)上清中PEDF的表達(dá)。MTT測(cè)定PMSCs-PEDF表達(dá)的PEDF對(duì)HUVECs增殖的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PMSCs-PEDF所表達(dá)的PEDF蛋白對(duì)HUVECs遷移的抑制作用。 結(jié)果 用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離的PMSCs進(jìn)行免疫表型分析，結(jié)果顯示，CD44、CD73、CD90、CD105表達(dá)呈陽性，而CD34、CD45表達(dá)呈陰性。Western blot結(jié)果顯示，重組腺病毒成功將PEDF基因傳送至PMSCs細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生分泌性的PEDF蛋白。ELISA結(jié)果顯示PMSCs-PEDF可并分泌高水平的PEDF至培養(yǎng)基中[(65.2±4.9)ng/ml]。MTT結(jié)果顯示，PMSCs-PEDF培養(yǎng)基上清在稀釋比例為1 ∶2時(shí)對(duì)HUVECs抑制率為56.3%±8.7%，隨著稀釋比例的增加抑制率逐漸降低。而PMSCs及PMSCs-null的培養(yǎng)基上清則對(duì)HUVECs抑制作用很弱。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PMSCs組(208.8±14.7)及PMSCs-null組(199.0±20.7)相比，PMSCs-PEDF組(79.4±14.5)可顯著抑制HUVECs遷移(均P<0.05)。 結(jié)論 PMSCs-PEDF可在體外高效表達(dá)PEDF蛋白，并抑制HUVECs細(xì)胞的增殖和遷移。

色素上皮衍生因子； 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移

在原發(fā)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中，血管生成擔(dān)任了非常重要的角色[1]。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種50 kD的分泌型糖蛋白，被認(rèn)為是最有潛力的內(nèi)源性抗血管生成因子。PEDF可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮其抗血管生成作用，甚至在VEGF存在的情況下，也可發(fā)揮作用。研究表明，純化的PEDF蛋白，或攜帶PEDF基因的病毒和非病毒載體已被證實(shí)對(duì)包括肺癌、肝癌、結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤有效[2-4]。但是較短的半衰期以及較大的毒副作用限制了這些方法的應(yīng)用[2,3]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞轉(zhuǎn)化。MSCs可以作為一種新型、高效的治療工具用于靶向傳送以及在腫瘤局部生產(chǎn)具有生物活性的藥物[5,6]。目前應(yīng)用最廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞來源是骨髓。但從骨髓中提取細(xì)胞只能通過侵入性操作獲得，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量也會(huì)隨之下降。許多研究指出，胎盤來源的MSCs(PMSCs)與骨髓來源的MSCs在細(xì)胞特性以及多向分化潛能方面都極其相似。而且，胎盤組織還滿足了兩個(gè)迫切需要解決條件：可獲得足夠多的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且使用無創(chuàng)的收集方法。并且由于胎盤來源的多潛能干細(xì)胞處于胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞，它們比成人骨髓MSCs具有更低的免疫原性。這些特性使PMSCs可作為一種非常有潛力的基因載體用于腫瘤的治療研究[7-9]。

本研究以PMSCs作為基因治療的靶向運(yùn)載工具，將攜帶有PEDF基因腺病毒轉(zhuǎn)染PMSCs(PMSCs-PEDF)，觀察PEDF表達(dá)情況，以及外源性PEDF對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外增殖、遷移的影響，探討PMSCs作為抗腫瘤基因治療載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和載體

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基(DMEM;Gibco BRL，Grand Island，USA)加入10%胎牛血清(FBS，Gibco，Auckland，NZ)，2 mmol/L鏈霉素和100 μg/ml阿米卡星。PEDF重組腺病毒載體(Ad-PEDF)由四川大學(xué)魏于全教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器

小鼠抗人PEDF單克隆抗體(R&D Systems，USA)，人PEDF蛋白ELISA試劑盒(GBD，USA)，MTT溶液(Sigma，USA)，DMSO溶液(Sigma，USA)。流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，USA)。超濾器(10 kD，Millipore，USA)，Transwell小室(Millipore，USA)。

1.3 分離、擴(kuò)增人的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞

取足月經(jīng)陰道產(chǎn)或經(jīng)剖腹產(chǎn)的胎兒的胎盤(根據(jù)醫(yī)院的規(guī)定并取得家屬同意)。剝除母體蛻膜，然后切開胎盤排出其中的臍帶血。剪碎胎盤后研磨并用0.1%Ⅳ型膠原酶消化，在勻漿中加入含有10%的胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(含2 mmol/L鏈霉素和100 μg/ml阿米卡星)，再將培養(yǎng)瓶置入含有5%CO2氣體的37 ℃孵育箱中培養(yǎng)。48 h后，不貼壁的造血細(xì)胞被棄去，而貼壁的MSCs被留下來進(jìn)一步擴(kuò)增。每周更換培養(yǎng)基兩次。第5-8代PMSCs被用于實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞儀通過檢測(cè)CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105等分子標(biāo)記來分析PMSCs的表型特征[8]。

1.4 腺病毒轉(zhuǎn)染PDMSCs

用HEK293細(xì)胞來擴(kuò)增腺病毒，并用梯度CsCl按照標(biāo)準(zhǔn)方法來純化腺病毒[10]。當(dāng)PMSCs傳代細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時(shí)，設(shè)感染復(fù)數(shù)(MOI)為1 500加入適量Ad-PEDF重組腺病毒，搖勻后置于37 ℃、5%CO2、95%濕度下的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后更換為無血清低糖DMEM培養(yǎng)基。同時(shí)，用未轉(zhuǎn)染病毒的PMSCs及空載腺病毒轉(zhuǎn)染PMSCs(PMSCs-null)作為對(duì)照。

1.5 Western blot分析和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEDF的表達(dá)

用腺病毒轉(zhuǎn)染PDMSCs 4 h，將含病毒的培養(yǎng)基更換為無血清低糖DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h后收集條件培養(yǎng)基(CM)。用超濾器濃縮條件培養(yǎng)基，然后用Western blot來檢測(cè)培養(yǎng)基中是否含有PEDF，用小鼠抗人PEDF單克隆抗體作為一抗。用檢測(cè)人PEDF蛋白的ELISA試劑盒來檢測(cè)條件培養(yǎng)基中分泌的PEDF濃度。

1.6 HUVECs遷移抑制實(shí)驗(yàn)

Transwell遷移試驗(yàn)用來明確Ad-PEDF轉(zhuǎn)染的PMSCs對(duì)HUVECs的遷移的影響。HUVECs(每孔2×104)以200 μl的條件培養(yǎng)基重懸，條件培養(yǎng)基分別來源于PMSCs、PMSC-null和PMSC-PEDF培養(yǎng)基上清。在Transwell小室上層底部用50 μl的基質(zhì)膠覆蓋，然后將HUVECs細(xì)胞懸液加入小室的上層。在小室的下層加入600 μl包含多種生長(zhǎng)因子的EBM-2培養(yǎng)基。將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h之后，未遷移的細(xì)胞被除去。而遷移到膜的另一面的細(xì)胞用100%甲醇固定，并用0.05%的結(jié)晶紫染色，用載玻片封片后，置于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)100倍下5個(gè)視野。

1.7 HUVECs增殖抑制實(shí)驗(yàn)

采用MTT法，檢測(cè)PMSCs-PEDF培養(yǎng)基上清中的PEDF蛋白對(duì)HUVECs增殖的影響。主要操作步驟：將HUVECs細(xì)胞懸液按2×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔體積100 μl。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后分別加入PMSCs、PMSCs-null、PMSCs-PEDF培養(yǎng)基上清100 μl，另有一組加入DMEM培養(yǎng)基100 μl作為陰性對(duì)照，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。得到數(shù)值后按如下公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=[1-(OD試驗(yàn)-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組資料之間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間用t檢驗(yàn)進(jìn)行處理。P<0.05可認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，PMSCs形態(tài)為典型成纖維細(xì)胞樣，以長(zhǎng)梭形為主，大量細(xì)胞呈渦旋狀生長(zhǎng)(見圖1)。MSCs缺乏特異性的表面標(biāo)志物，通常認(rèn)為MSCs陽性表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105等表面分子，而不表達(dá)CD34、CD45等造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的分子。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代PMSCs上的表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示CD44、CD73、CD90、CD105均呈陽性表達(dá)，而造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD34、CD45則呈陰性表達(dá)(見圖2)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。證明本實(shí)驗(yàn)所分離的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖1 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)Figure 1 Morphology of human placenta mesenchymal stem cells

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析PMSCs表面標(biāo)志物Figure 2 Analysis of the PMSCs markers by flow cytometry

2.2 檢測(cè)PMSCs-PEDF對(duì)PEDF蛋白表達(dá)的影響

當(dāng)PMSCs培養(yǎng)達(dá)到大約90%細(xì)胞融合時(shí)，用MOI(感染復(fù)數(shù))為1 500的腺病毒共培養(yǎng)4 h，然后更換為無血清低糖DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育48 h后，將PMSCs培養(yǎng)基上清中分泌的PEDF的量用Western blot和ELISA檢測(cè)。Western blot結(jié)果顯示：從PMSCs-PEDF的培養(yǎng)上清液中可見到明顯的PEDF蛋白條帶，而PMSCs-null組和未轉(zhuǎn)染的PMSCs組上清液中則未見條帶顯示，證明PDMSCs-PEDF可成功表達(dá)PEDF并分泌至培養(yǎng)基中(見圖3)。ELISA結(jié)果顯示分泌至培養(yǎng)基中的PEDF濃度為(65.2±4.9)ng/ml，而其余兩組中PEDF含量極低，幾乎不能檢測(cè)出(見圖4)。

2.3 PMSCs-PEDF抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖

光鏡觀察(×100)顯示，PMSCs-PEDF組每視野下發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為79.4±14.5個(gè)，而PMSCs組為208.8±14.7個(gè)、PMSCs-null組為199.0±20.7個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5A，B)。以上結(jié)果說明PMSCs-PEDF組的培養(yǎng)上清顯著抑制了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而PMSCs-null組和PMSCs

組的培養(yǎng)上清對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移則無明顯抑制作用。

圖3 Western blot檢測(cè)PMSCs-PEDF分泌的PEDFFigure 3 Expression of PEDF secreted by PMSCs-PEDF by Western blot

圖4 ELISA檢測(cè)PMSCs-PEDF培養(yǎng)基中的PEDF濃度Figure 4 PEDF concentration in the medium derived from PMSCs-PEDF by ELISA

圖5 PMSCs-PEDF體外抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖的作用 (×100)Figure 5 Effect of PMSCs-PEDF on the HUVECs migration and proliferation in vitro (×100)

通過MTT法檢測(cè)PMSCs-PEDF分泌的色素上皮衍生因子蛋白對(duì)人HUVECs的增殖抑制情況，以PMSCs及PMSCs-null的培養(yǎng)上清作為對(duì)照組。結(jié)果顯示，PMSCs-PEDF培養(yǎng)基上清在稀釋比例為1 ∶2時(shí)對(duì)HUVECs抑制率為56.3%±8.7%，隨著稀釋比例的增加抑制率逐漸降低，說明抑制率與濃度呈劑量依賴效應(yīng)。相反，PMSCs及PMSCs-null的培養(yǎng)基上清則對(duì)HUVECs抑制作用很弱(P<0.05，見圖5C)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶PEDF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染PMSCs后，PMSCs-PEDF所分泌的PEDF蛋白具有抗血管生成的生物活性。

3 討論

血管形成在腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。PEDF作為最有效的天然抗血管生成因子，其抗血管生成作用在多種腫瘤中已被證實(shí)。PEDF可通過激活Fas/FasL凋亡途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞死亡，并調(diào)節(jié)促血管生成和抗血管生成因子之間的平衡，抑制血管生成刺激因子引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移動(dòng)，從而間接抑制腫瘤生長(zhǎng)[2]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，含有PEDF的PMSCs-PEDF培養(yǎng)基上清可抑制HUVECs的成管、遷移及增殖。除此之外，它還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟等直接抗腫瘤作用。此前大量的研究顯示，攜帶PEDF基因的腺病毒在黑色素瘤、肺癌等多種腫瘤中表現(xiàn)出明顯的抑瘤效果[4]。但由于腺病毒載體的高免疫源性，易在體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體而迅速被清除，使其很難在瘤體中達(dá)到有效濃度，而單純通過增大腺病毒的劑量來提高治療濃度則可能發(fā)生嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此需要更加安全有效的基因運(yùn)載工具。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于中胚層的非造血干細(xì)胞，除干細(xì)胞所具有的增殖、自我更新、分化能力外，其還具有低免疫原性和腫瘤趨向性[5]。人們通過細(xì)胞工程技術(shù)將其改造成為各種抗瘤成分的載體，使其攜帶抗癌因子、溶瘤病毒、抗瘤藥物納米微粒、抗癌藥物前體轉(zhuǎn)化因子等成分，在其注入實(shí)驗(yàn)體后遷移至腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶釋放目的成分，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[6]。骨髓、脂肪組織等途徑均可獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，兩種方法獲取的細(xì)胞數(shù)量較少，且與供者的身體狀況、身體機(jī)能、年齡等相關(guān)，并且從骨髓中獲取干細(xì)胞給提供者帶來較大的痛苦。作為一種替代來源，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有多方面的優(yōu)勢(shì)：胎盤可以在每次生產(chǎn)中獲得并且它的使用不會(huì)構(gòu)成任何道德問題，因此來源非常廣泛。并且與骨髓捐獻(xiàn)相比，供者無痛苦，污染機(jī)會(huì)少。PMSCs較骨髓MSCs增殖迅速，且有更強(qiáng)的長(zhǎng)期增殖能力[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)從胎盤組織中成功分離及培養(yǎng)得到了足量的可穩(wěn)定傳代的PMSCs，并通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記的分析，證實(shí)該細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。用攜帶PEDF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染PMSCs后，從PMSCs-PEDF培養(yǎng)基中檢測(cè)到了較高濃度的PEDF蛋白表達(dá)，而在PMSCs及PMSCs組中，PEDF的表達(dá)量幾乎檢測(cè)不出。說明已將目的基因成功地轉(zhuǎn)染入PMSCs中，使其能夠穩(wěn)定產(chǎn)生PEDF并分泌至細(xì)胞外。PMSCs-PEDF的培養(yǎng)基上清可抑制人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成管、遷移及增殖，而對(duì)照組則無此作用，表明其分泌的PEDF蛋白具有生物活性。

因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PMSCs可作為一種高效的基因載體應(yīng)用于腫瘤的治療。但仍需要進(jìn)一步的研究來探討其在體內(nèi)對(duì)腫瘤的靶向性，在體內(nèi)對(duì)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)程度，并觀察其安全性。

[1] Berretta M,Rinaldi L,Di Benedetto F,etal.Angiogenesis inhibitors for the treatment of hepatocellular carcinoma[J].Front Pharmacol，2016，7:428.

[2] Belkacemi L,Zhang SX.Anti-tumor effects of pigment epithelium-derived factor(PEDF):implication for cancer therapy.A mini-review[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35:4.

[3] Hoshina D,Abe R,Yamagishi SI,etal.The role of PEDF in tumor growth and metastasis[J].Curr Mol Med,2010,10(3):292-295.

[4] Broadhead ML,Dass CR,Choong PF.Invitroandinvivobiological activity of PEDF against a range of tumors[J].Expert Opin Ther Targets,2009,13(12):1429-1438.

[5] Ramdasi S,Sarang S,Viswanathan C.Potential of mesenchymal stem cell based application in cancer[J].Int J Hematol Oncol Stem Cell Res,2015,9(2):95-103.

[6] Li Z,Fan D,Xiong D.Mesenchymal stem cells as delivery vectors for anti-tumor therapy[J].Stem Cell Investig,2015,2:6.

[7] Malek A,Bersinger NA.Human placental stem cells:biomedical potential and clinical relevance[J].J Stem Cells,2011,6(2):75-92.

[8] Parolini O,Alviano F,Bagnara GP,etal.Concise review:isolation and characterization of cells from human term placenta:outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells[J].Stem Cells,2008,26(2):300-311.

[9] Matikainen T,Laine J.Placenta-an alternative source of stem cells[J].Toxicol Appl Pharmacol，2005,207(2 Suppl):544-549.

[10] Yang LP,Cheng P,Peng XC,etal.Anti-tumor effect of adenovirus-mediated gene transfer of pigment epithelium-derived factor on mouse B16-F10 melanoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2009,28:75.

PEDF expressed by human placenta mesenchymal stem cells inhibits human umbilical vein endothelial cell proliferation and migration

CHEN Qiaoling1,BAI Yiguang2,XIAO Dongqin3,LIU Kang3,FENG Gang3*

(1DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2OrthopedicDepartment,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:lssmd18@gmail.com)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect of human placenta mesenchymal stem cells(PMSCs)transfected by recombinant adenoviruses loaded with pigment epithelium-derived factor(PEDF)gene on the human umbilical vein endothelial cell(HUVECs)proliferation and migration.MethodsPMSCs were isolated from full-term pregnancy human placenta by the method of enzyme digestion.The cells were culturedinvitro.The phenotype characteristics of PMSCs were analyzed by flow cytometry.The PMSCs were transfected with recombinant adenovirus-loaded PEDF gene(Ad-PEDF),and then the expression of PEDF was detected by Western blot and ELISA.MTT assay was performed to observe the inhibitive effect of PMSCs-PEDF on HUVECs proliferation,and Transwell assay was used to determine the inhibitive effect of PEDF expressed by Ad-PEDF-infected PMSCs(PMSCs-PEDF)on HUVECs.ResultsFlow cytometry showed that isolated PMSCs exhibited classical immunophenotype of MSCs,including positive CD44,CD73,CD90,CD105,but negative CD34,CD45.Western blot results showed that recombinant adenovirus successfully transfered the PEDF gene into PMSCs and produced secretory PEDF protein.ELISA results showed that PMSCs-PEDF secreted high level of PEDF into the medium[(65.2±4.9)ng/ml].MTT assay showed that PMSCs-PEDF inhibited HUVEC proliferation by 56.3%±8.7% at a 1 ∶2 dilution concentration,and the inhibitory rate decreased with the increase of dilution concentration in a dose-dependent manner.The medium from PMSCs or PMSCs-null had very weak inhibitory effect on the proliferation of HUVECs.The transwell assay demonstrated that PMSCs-PEDF significantly reduced HUVECs migration compared with PMSCs or PMSCs-null(79.4±14.5vs208.8±14.7,199.0±20.7,P<0.05).ConclusionPEDF is highly expressed by PMSCs-PEDF and can inhibit HUVECs proliferation and migration.

pigment epithelium-derived factor； placenta mesenchymal stem cells； human umbilical vein endothelial cell； cell proliferation； cell migration

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30872614)；四川省教育廳理科重點(diǎn)資助項(xiàng)目(15ZA0216，15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項(xiàng)目(14A0017，14A0022)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(CBY14-A-ZD02，CBY15-A-ZD02)；四川省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(16PJ202)

陳巧玲，女，1983-02生，博士，主治醫(yī)師，E-mail:cql166@163.com

2016-12-22

R329

A

1007-6611(2017)03-0226-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.006