干擾素誘導(dǎo)蛋白-10在肝源性糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)的研究

劉曉燕，呂 勇，王艷麗，朱金照，崔永良，熊 偉，吳旭偉，韓荔芬

干擾素誘導(dǎo)蛋白-10在肝源性糖尿病患者體內(nèi)表達(dá)的研究

劉曉燕，呂 勇，王艷麗，朱金照，崔永良，熊 偉，吳旭偉，韓荔芬

目的探討干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducibe protein 10, IP-10）在肝源性糖尿病患者肝組織及血清中表達(dá)水平，進(jìn)一步探討其與肝源性糖尿病的關(guān)系。方法用ELISA、Real-time PCR以及免疫組織化學(xué)法檢測60例肝源性糖尿病患者及60例普通肝病患者血清及肝組織中IP-10的表達(dá)水平。結(jié)果在肝源性糖尿病患者中，ELISA法檢測血清中IP-10的表達(dá)水平為（239.542±28.603）pg/ml，明顯高于對(duì)照組的（205.341±26.952） pg/ml（P＜0.05）；Real-time PCR法檢測肝組織中IP-10 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。用免疫組織化學(xué)法檢測肝組織IP-10表達(dá)陽性率，肝源性糖尿病組為30.0%（18/60），高于普通肝病組的11.7%（7/60）（P＜0.05）。結(jié)論IP-10在肝源性糖尿病患者血清和肝組織中有著高水平表達(dá)。

干擾素誘導(dǎo)蛋白-10；肝源性糖尿病；炎癥因子

肝功能損害可造成機(jī)體糖原代謝紊亂和糖尿病的發(fā)生。有資料證明，約有50%～80%慢性肝病患者糖耐量降低，而其中的20%～30%最終可能會(huì)發(fā)展為糖尿病[1]。有數(shù)據(jù)表明，持續(xù)高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損害甚至進(jìn)展為肝衰竭[2]。干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-induced protein 10, IP-10）是由干擾素刺激內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等誘導(dǎo)產(chǎn)生的能趨化T淋巴細(xì)胞的一類分泌性糖蛋白，又稱作CXC趨化因子配體10，目前國內(nèi)外諸多關(guān)于IP-10的研究認(rèn)為IP-10在各種炎癥因子介導(dǎo)的疾病中均有重要意義，但在肝源性糖尿病中的表達(dá)少有研究。本文通過檢測肝源性糖尿病患者血清及肝組織中IP-10的表達(dá)水平，探討其與肝源性糖尿病發(fā)生的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 所有取材均來自福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院肝組織穿刺標(biāo)本和外科手術(shù)治療標(biāo)本（外科手術(shù)標(biāo)本為遠(yuǎn)離病變組織的肝炎及肝硬化組織標(biāo)本），按標(biāo)本來源將患者分為2組：肝源性糖尿病組和普通肝病組，每組均包括普通肝炎患者30例和肝硬化患者30例，2組在性別、年齡、ALT水平、HBsAg定量、 HBV DNA定量方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（表1）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 患者均為HBV感染的慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎肝硬化患者，其診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015更新版）[3]的標(biāo)準(zhǔn)。肝源性糖尿病診斷：①有明確的肝病史且在糖尿病發(fā)生之前，或同時(shí)發(fā)生；②無糖尿病史及糖尿病家族史；③肝功能損害臨床表現(xiàn)明顯，并有客觀檢查證據(jù)支持；④符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；⑤胰島素釋放試驗(yàn)：空腹胰島素水平偏高，餐后胰島素反應(yīng)延遲或反應(yīng)不良；血清C肽釋放試驗(yàn)可正?；蛳陆?，C肽與胰島素的比值明顯減少；⑥肝功能的改變可導(dǎo)致血糖的惡化或好轉(zhuǎn)；⑦可排除其他疾病引起的血糖升高等糖代謝異常，包括無腎上腺、甲狀腺、垂體組織器官的疾病，排除藥物如降壓藥、利尿劑、避孕藥及糖皮質(zhì)激素等引起的糖代謝紊亂等。同時(shí)排除心、腦、腎及其他器官嚴(yán)重功能不全者及并發(fā)其他嚴(yán)重疾病者[4]。

表1 2組基本臨床資料Table 1 Basic clinical data of 2 groups

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 所用試劑為：血清IP-10 ELISA檢測試劑盒（美國Sigma公司），AMV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物公司），SP超敏試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司），IP-10單抗（美國GeneTex公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.2.2 儀器 所用儀器為：全自動(dòng)酶標(biāo)儀EXL808（美國Bio-Tek公司），iCycle Real-time PCR儀iCyele（美國Bio-Rad有限公司），電腦全自動(dòng)組織脫水機(jī)ZMN-9802（常州市華利電子有限責(zé)任公司），動(dòng)組織包埋機(jī)ZMN-7803（常州市華利電子有限責(zé)任公司），石蠟切片機(jī)LEICARM 2128（德國Leica有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 ELISA法檢測血清IP-10水平 采患者空腹靜脈血5 ml，分離血清，用ELISA雙抗體夾心法檢測IP-10濃度。

1.3.2 Real-time PCR法提取總RNA 用RT-PCR及Real-time PCR對(duì)IP-10進(jìn)行定性與定量的測定。IP-10引物序列：上游引物5′-CGA TTCTGA TTTGCTGCCTTA T-3′/下游引物5′-CTTCTCACCCTTCTTTTTCA TTG T-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） 可用于RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)對(duì)照。GAPDH引物序列為上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′/下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)條件均為95 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min；57 ℃ 1min；74 ℃2 min，循環(huán)30次。74 ℃ 延伸10 min?？赏ㄟ^DNA測序證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為人IP-10。以肝組織標(biāo)本中提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入IP-10和GAPDH的特異引物，并進(jìn)行擴(kuò)增。lg cDNA/lg GAPDH比值可以代表標(biāo)本中IP-10 mRNA的水平。

1.3.3 免疫組織化學(xué)（免疫組化）SP移動(dòng)法檢測肝組織IP-10表達(dá)量 免疫組化SP法具有較高的敏感性，鏡下觀察有深褐色著色者為陽性，定位于胞膜和胞漿。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，定量資料呈正態(tài)分布，用±s表示，2組比較用成組t檢驗(yàn)。2組定性資料比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA法檢測2組血清中IP-10水平 肝源性糖尿病組血清IP-10水平（239.542±28.603）pg/ml高于普通肝病組（205.341±26.952）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.742, P=0.001）。

2.2 Real-time PCR法檢測肝組織中IP-10 mRNA的水平 IP-10 mRNA表達(dá)量用lg cDNA/lg GAPDH比值表示，肝源性糖尿病組肝組織IP-10 mRNA的水平（0.553±0.924）高于普通肝病組（0.264±0.647），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.032，P=0.042）。

2.3 免疫組化法檢測肝組織IP-10表達(dá)陽性率 肝源性糖尿病組IP-10表達(dá)陽性率為30.0%（18/60），高于普通肝病組的11.7%（7/60）（χ2=6.110, P=0.016），見圖1。

3 討 論

目前認(rèn)為肝源性糖尿病的發(fā)生與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)有關(guān)。慢性肝病患者體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子、炎性因子可能參與了糖代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制，其中分泌胰島素的胰島β細(xì)胞在受到自身免疫攻擊時(shí)部分被破壞凋亡[5-6]。淋巴細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞的一種，它在胰島β細(xì)胞的破壞中起著一定的作用，但是淋巴細(xì)胞由血液遷移至胰島炎癥部位的機(jī)制目前尚無定論。趨化因子是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移和定位的關(guān)鍵性因子，IP-10能被IFN-γ所誘導(dǎo)，主要與Thl細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)，并與T細(xì)胞膜上的CXCR-3結(jié)合，通過三磷酸鳥苷的消耗，使Gβγ 亞基二聚體解離出Gα亞基，使之具有調(diào)節(jié)活性，從而級(jí)聯(lián)激活多種酶，通過各種細(xì)胞通路，發(fā)揮吞噬、趨化、呼吸暴發(fā)、細(xì)胞脫顆粒等作用[7-9]。在肝細(xì)胞中產(chǎn)生IP-10，使之與CXCR-3結(jié)合，從而趨化單核細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，使NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞死亡，以及T淋巴細(xì)胞附著血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管生成等[10-12]。國外研究者曾利用IL-1β、INF-γ和dsRNA刺激體外培養(yǎng)的小鼠和人的胰島β細(xì)胞，檢測到高濃度的IP-l0，顯示炎癥性細(xì)胞因子和病毒能夠刺激胰島β細(xì)胞產(chǎn)生大量的IP-10[13-14]。因此IP-l0可能作為炎癥趨化因子在肝源性糖尿病發(fā)生中起一定的作用。在本研究中，應(yīng)用ELISA、RT-PCR、免疫組化等方法檢測了血清及肝組織中IP-10表達(dá)水平，表明了肝源性糖尿病患者血清及肝組織中IP-10的表達(dá)水平均明顯高于普通肝病患者，驗(yàn)證了IP-10通過炎癥機(jī)制在肝源性糖尿病的發(fā)生中可能起著一定的作用，當(dāng)然，在本研究中還可以對(duì)患者病程中及治療前后IP-10水平進(jìn)行分析，從而探討IP-10水平與肝源性糖尿病發(fā)展嚴(yán)重程度的關(guān)系。今后在進(jìn)一步的研究中可擴(kuò)大標(biāo)本量增加普通肝病組的病種種類，為IP-10的表達(dá)水平在肝源性糖尿病發(fā)生中的作用尋找更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

圖1 肝源性糖尿病患者肝組織IP-10免疫組化染色左圖.×100，右圖.×40Figue 1 Mmunohistochemical study of IP-10 in patients with hepatic diabetes

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（2016-08-05收稿 2016-12-10修回）

（本文編輯 張?jiān)戚x）

Research of the expression of interferon inducible protein 10 in patients with hepatogenous diabetes

LIU Xiao-yan, Lü Yong*, WANG Yan-li, ZHU Jin-zhao, CUI Yong-liang, XIONG Wei, WU Xu-wei, HAN Li-fen
Department of Gastroenterology, Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350025, China
*Corresponding author, E-mail: 364299238@qq.com

ObjectiveTo observe the expression of interferon inducible protein 10(IP-10) in serum and liver tissues of patients with hepatogenous diabetes, and the relationship between IP-10 and the occurrence of hepatogenous diabetes.MethodsELISA, Real-time PCR and immunohistochemistry method were used to test the IP-10 level in serum and liver tissues for 60 hepatic diabetes patients and 60 cases with common liver disease.ResultsThe level of IP-10 in serum of patients with hepatogenous diabetes was (239.542±28.603) pg/ml, which was significantly higher than that in control group(205.341±26.952) pg/ml (P＜0.05). Tested by the method of Real-time PCR, the level of IP-10 in liver tissue of patients with hepatogenous diabetes was significantly higher than that of control group (P＜0.05). Using the method of immunohistochemistry, the IP-10 expression positive rate was 30.0% (18/60) for the hepatogenous diabetes group, which was higher than that of common liver disease group (11.7%, 7/60), (P＜0.05).ConclusionsExpression level of IP-10 protein is high in the serum and liver tissue of patients with hepatogenous diabetes.

interferon inducible protein 10; hepatogenous diabetes; inflammatory cytokines

R587.1

A

1007-8134(2017)01-0038-03

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.012

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-S-139-8）

350025 福州，福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院消化科（劉曉燕、呂勇、王艷麗、朱金照、崔永良、熊偉、吳旭偉、韓荔芬）

呂勇，E-mail: 364299238@qq.com