碎秈米蛋白質(zhì)中性蛋白酶酶法提取工藝優(yōu)化

李玉珍，肖懷秋

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南株洲 412000）

碎秈米蛋白質(zhì)中性蛋白酶酶法提取工藝優(yōu)化

李玉珍，肖懷秋

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南株洲 412000）

為提高碎秈米蛋白質(zhì)提取率，在析因設(shè)計(jì)和爬陡坡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用中心組合響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對(duì)碎秈米蛋白質(zhì)中性蛋白酶酶法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化分析，建立了碎秈米蛋白質(zhì)酶法提取工藝二階多項(xiàng)式非線性回歸方程和數(shù)值模型，驗(yàn)證了模型精準(zhǔn)度并分析了加酶量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和固液比（X3）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響規(guī)律，以蛋白質(zhì)提取率和蛋白質(zhì)純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。優(yōu)化方案為加酶量0．98%，固液比1∶10．20，酶解時(shí)間74．4 min，pH7．0和50℃。在優(yōu)化條件下蛋白質(zhì)提取率為89．82%±1．06%（n＝3），與模型預(yù)測(cè)值91．23%基本吻合，偏差為－1．55%，所提取大米蛋白質(zhì)純度為81．02%。

碎秈米蛋白質(zhì)；中性蛋白酶；酶法提??；響應(yīng)面優(yōu)化

由于當(dāng)前碾米技術(shù)水平的限制，大米加工中會(huì)產(chǎn)生10%～15%的碎米，我國(guó)每年碎米產(chǎn)量達(dá)到2 000～3 000萬t，特別是秈米，由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性，碎米率更高［1］。碎秈米營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，氨基酸配比合理，特別是賴氨酸是谷物中最高的，而且大米蛋白質(zhì)是谷物中唯一的低過敏性蛋白質(zhì)［2］。隨著人們對(duì)大米蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和低過敏性的認(rèn)同，大米蛋白質(zhì)研究成為一個(gè)新的熱點(diǎn)。大米中蛋白質(zhì)主要為堿溶性的米谷蛋白，在胚乳中與淀粉結(jié)合緊密，較難溶出，堿液處理能降低蛋白質(zhì)與淀粉結(jié)合作用力，使極性基團(tuán)發(fā)生解離，并使大米蛋白質(zhì)分子表面帶負(fù)電荷，起到增溶作用，有利于淀粉與蛋白質(zhì)的分離［3］，堿法提取成為當(dāng)前大米蛋白質(zhì)提取的主要方法。孫慶杰［4］、萬娟［5］、王威［6］等人研究了大米蛋白質(zhì)堿法提取工藝并進(jìn)行優(yōu)化分析。堿法提取工藝簡(jiǎn)單，操作方便，可疏松大米淀粉—蛋白質(zhì)緊致結(jié)構(gòu)，但堿液易造成大米蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的改變，破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值銳減并產(chǎn)生潛在有毒物質(zhì)。而且堿法提取液中淀粉含量高，等電沉淀需消耗大量酸，透析脫鹽難度大，因此，大米蛋白質(zhì)提取逐步向酶法提取轉(zhuǎn)變。葛娜［7］、趙叢叢［8］、王章存［9］等研究了堿性蛋白酶酶法提取大米蛋白工藝條件。堿法提取雖反應(yīng)條件溫和，液固比小，但存在酶解產(chǎn)物發(fā)生Maillard反應(yīng)嚴(yán)重，需消耗大量堿液以維持其堿性環(huán)境以及產(chǎn)物有咸味等缺陷，實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制［10］。鑒于堿法提取和堿性蛋白酶法提取過程存在的諸多問題，本實(shí)驗(yàn)利用中性蛋白酶進(jìn)行碎秈米蛋白質(zhì)的酶法提取，在析因設(shè)計(jì)和爬陡坡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用中心組合響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對(duì)碎秈米蛋白質(zhì)酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建影響因素?cái)?shù)值模擬，以期為碎秈米蛋白質(zhì)高效增值加工提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 材料

碎秈米：市售；中性蛋白酶（5．2×104U／g）：北京中生瑞泰科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．1．2 主要儀器與設(shè)備

LABCONCO冷凍干燥儀：美國(guó)Labconco公司；HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hermle公司；722型可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 碎秈米常規(guī)組分分析

蛋白質(zhì)測(cè)定采取凱氏定氮法、脂肪測(cè)定采取索氏抽提法、水分測(cè)定采取直接干燥法、灰分測(cè)定采取灼燒法進(jìn)行含量測(cè)定［11］。

1．2．2 碎秈米蛋白質(zhì)酶法提取工藝

準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)烘干并粉碎（80目）的碎秈米于酶解反應(yīng)體系中，依據(jù)固液比要求加入去離子水?dāng)嚢杈鶆?，超聲波預(yù)處理10 min，調(diào)節(jié)pH值，根據(jù)加酶量要求精準(zhǔn)稱取中性蛋白酶添加到反應(yīng)器中并緩慢攪拌，酶解過程注意維持pH恒定，酶解完成后滅酶，用4 000 r／min離心20 min，收集上清液并冷凍干燥，即得到碎秈米蛋白質(zhì)。

1．2．3 碎秈米蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

1．2．3．1 Min－Run Res IV析因設(shè)計(jì)

在預(yù)備實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察加酶量、酶解時(shí)間、固液比、酶解pH和酶解溫度5個(gè)因素對(duì)碎秈米蛋白質(zhì)提取的影響。實(shí)驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 析因設(shè)計(jì)因素與水平

1．2．3．2 爬陡坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化所擬合回歸方程只有在最優(yōu)鄰域才能充分近似真實(shí)條件，若偏離最優(yōu)鄰域，擬合方程將與真實(shí)條件不符或失去實(shí)際意義［12］。為使各因素同時(shí)逼近最優(yōu)鄰域，基于析因設(shè)計(jì)方差分析和主效分析結(jié)果以及模型系數(shù)符號(hào)設(shè)定主效因素爬坡方向及步長(zhǎng)。

1．2．3．3 響應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對(duì)酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化分析。各因素均設(shè)置5水平，即±r（上下星號(hào)臂），±1（上下水平點(diǎn)）和0（零水平，n＝3），本實(shí)驗(yàn)星號(hào)臂r＝1．682。實(shí)驗(yàn)因素與編碼水平如表2。在優(yōu)化條件下重復(fù)3次提取實(shí)驗(yàn)并對(duì)比模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差以驗(yàn)證模型精準(zhǔn)度。

表2 因素編碼與實(shí)際水平

1．2．4 蛋白質(zhì)含量與提取率測(cè)定

碎秈米固體蛋白質(zhì)和溶液蛋白質(zhì)分別采用凱氏定氮法測(cè)定（轉(zhuǎn)換系數(shù)為5．95［13］）和考馬氏亮蘭法測(cè)定。蛋白質(zhì)提取率與純度按下式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2．1 碎秈米常規(guī)組分分析

對(duì)碎秈米常規(guī)組分含量進(jìn)行了分析，水分含量為10．6%，蛋白質(zhì)含量為8．17%，脂肪含量為1．34%，灰分含量為0．87%。

2．2 Min－Run Res IV析因設(shè)計(jì)

加酶量、固液比、酶解時(shí)間、酶解pH和酶解溫度對(duì)碎秈米蛋白質(zhì)提取的影響見表3。

利用Design expert 8．0．6對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到線性回歸方程為y＝59．96＋12．40X1＋3．30X2＋5．80X3－1．15X4＋3．29X5。

表3 Min－Run Res IV析因設(shè)計(jì)因素水平與結(jié)果

對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和主效分析，得到各因素影響顯著性和百分貢獻(xiàn)率如表4。

表4 析因設(shè)計(jì)方差與主效分析結(jié)果

從表4可看出，模型顯著性分析為極顯著（P＜0．01），信躁比為（SNR）為18．549（＞4），說明模型精度符合要求。由于模型存在交互作用，不能用回歸系數(shù)絕對(duì)值表示因素作用的大小，宜采用因子百分貢獻(xiàn)率來比較［12］。其中，X1、X2、X3、X5百分貢獻(xiàn)率分別為69．86%、4．63%、14．34%和4．61%，累積之和為93．44%，為主效因子。

2．3 爬陡坡實(shí)驗(yàn)

各主效因素爬坡方向及步長(zhǎng)見表5。

由表5可看出，最優(yōu)鄰域在3號(hào)，提取率最高（81．67%），此條件作為中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

表5 爬陡坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2．4 響應(yīng)面優(yōu)化分析

對(duì)加酶量、固液比和酶解時(shí)間進(jìn)行中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化分析，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表6。為減少實(shí) 驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)安排。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（含模型預(yù)測(cè)值）

2．4．1 響應(yīng)面模型序貫分析與數(shù)學(xué)建模

響應(yīng)面模型序貫分析結(jié)果如表7所示。

表7 響應(yīng)面模型構(gòu)建序貫分析

由表7可以看出，一階線性模型顯著性分析為不顯著（P＞0．05），失擬項(xiàng)極顯著（P＜0．01）。失擬項(xiàng)顯著表示用該模型進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)可能存在較大誤差，需用更高階模型進(jìn)行數(shù)值擬合［14］；二因素交互關(guān)系模型失擬項(xiàng)也極顯著（P＜0．01），也不宜對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。二階模型顯著性分析為極顯著（P

＜0．001），且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0．05），可用于數(shù)值模擬。三階模型顯著性分析不顯著（P＞0．05），失擬項(xiàng)顯著（P＜0．05），不宜用于數(shù)值分析。因此，選擇二階模型進(jìn)行數(shù)值擬合分析是最合適的。對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式非線性回歸擬合可得到回歸方程為：y＝88．80＋5．25X1＋4．13X2＋4．90X3－1．12X1X2＋0．88X1X3－1．41X2X3－6．45X12－12．28X22－6．82X32。

2．4．2 回歸模型方差分析

模型方差分析結(jié)果如表8所示。

表8 回歸模型方差分析

從表8可看出，模型影響極顯著（P＜0．01）。確定系數(shù)為0．99 06，說明能解釋總變異的99．06%。變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）是衡量模型精密度和可靠性的重要參數(shù)，數(shù)值越小表示模型越可靠［15］。模型CV為2．88%；模型信噪比（SNR）為27．642（＞4），信躁比大于4表明所構(gòu)建模型是可靠的［13］；失擬項(xiàng)不顯著（P＞0．05）表示應(yīng)用該數(shù)值模型進(jìn)行數(shù)值估測(cè)不會(huì)造成失真，本模型失擬項(xiàng)不顯著（P＞0．05）。模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)影響均極顯著（P＜0．01），而交互作用項(xiàng)影響均不顯著（P＞0．05）。直接比較回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小和基于模型方差分析可判定因子影響的主次順序［14］，即加酶量（X1）＞酶解時(shí)間（X3）＞固液比（X2），與析因設(shè)計(jì)結(jié)果一致。

2．4．3 降維分析（交互作用分析）

當(dāng)其它因素為零水平時(shí)觀察某兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可繪制出交互因素項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。響應(yīng)曲面坡度平緩，表明因素變化對(duì)響應(yīng)值影響不大，若響應(yīng)曲面坡度非常陡則說明因素變化對(duì)響應(yīng)值影響顯著［15］。由圖1可看出，因素交互作用項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響均不顯著。

圖1 y＝f（X1，X2），y＝f（X1，X3）和y＝f（X2，X3）響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2．4．4 模型最優(yōu)解求解與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將回歸方程分別對(duì)各自變量求一階偏導(dǎo)并令結(jié)果為零，聯(lián)立方程組解逆矩陣可得到方程最優(yōu)解：x1＝0．45，x2＝0．17和x3＝0．37，即加酶量0．98%，固液比1∶10．20（g∶mL），酶解時(shí)間74．4 min。為驗(yàn)證模型精準(zhǔn)度，在優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為89．82%±1．06%（n＝3），與模型預(yù)測(cè)值91．23%基本吻合，偏差為－1．55%，提取大米蛋白質(zhì)純度為81．02%。

3 結(jié)語(yǔ)

響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)通過局部?jī)?yōu)化來擬合因素與響應(yīng)值的全局函數(shù)關(guān)系，并對(duì)因素及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)分析的實(shí)驗(yàn)方法，二次旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、計(jì)算簡(jiǎn)便、回歸系數(shù)間無相關(guān)性等優(yōu)點(diǎn)，利用旋轉(zhuǎn)性還可克服預(yù)測(cè)值方差對(duì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在因子空間位置的依賴性［15－16］。本實(shí)驗(yàn)在析因設(shè)計(jì)、爬陡坡實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)研究了碎秈米蛋白質(zhì)提取的影響機(jī)制并進(jìn)行了優(yōu)化分析，驗(yàn)證了模型精準(zhǔn)度，分析了加酶量、酶解時(shí)間和固液比對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響，獲得了碎秈米蛋白質(zhì)中性蛋白酶酶法提取優(yōu)化條件，即加酶量0．98%，固液比1∶10．20（g∶mL），酶解74．4 min，pH 7．0和50℃。重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為89．82%±1．06%，與模型預(yù)測(cè)值基本接近，偏差為－1．55%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于王威［16］等以米渣為對(duì)象的中性蛋白酶酶法提取率。蛋白質(zhì)提取率與孫慶節(jié)［4］堿法提取結(jié)果相近，蛋白質(zhì)提取率和純度均優(yōu)于萬娟［5］堿法提取工藝。與葛娜［7］、趙叢叢［8］等堿性蛋白酶酶法提取相比，蛋白質(zhì)提取率和純度均優(yōu)于文獻(xiàn)結(jié)果。結(jié)果表明，利用中性蛋白酶進(jìn)行碎秈米蛋白質(zhì)提取可以獲得滿意的結(jié)果，而析因設(shè)計(jì)、爬陡坡實(shí)驗(yàn)與中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)聯(lián)用可以很好的用于碎秈米的蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化分析。

［1］滕碧蔚．碎米資源及其綜合利用概述［J］．輕工科技，2013，（1）：13－14．

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［5］萬娟，陳嘉東，鐘國(guó)才，等．堿法提取碎秈米中大米蛋白工藝的研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2009，25（9）：1073－1075

［6］王威，張?jiān)绿?，曾凡駿．響應(yīng)面優(yōu)化堿法提取大米蛋白工藝［J］．糧食與飼料工業(yè)，2007（9）：20－21，25．

［7］葛娜，易翠平，姚惠源．堿性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究［J］．糧食與飼料工業(yè)，2006（4）：25－27

［8］趙叢叢，曾里，宋娜，等．堿性蛋白酶提取大米水解蛋白的研究［J］．食品與發(fā)酵科技，2010，46（1）：85－88

［9］王章存，劉衛(wèi)東，申瑞玲，等．大米蛋白的酶水解機(jī)制研究－Ⅱ酶水解過程中蛋白質(zhì)的組分變化［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2007，22（4）：5－8，13

［10］鄭麗娜．淀粉酶法提取大米蛋白［J］．食品研究與開發(fā)，2012，33（6）：60－63

［11］楊月欣．實(shí)用食品營(yíng)養(yǎng)成分分析手冊(cè)［M］．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2006：36－85，162－163

［12］李玉珍，肖懷秋，楊濤，等．響應(yīng)面優(yōu)化低值豆粕液態(tài)制備多肽工藝［J］．大豆科學(xué)，2012，31（4）：649－654

［13］中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)．GB 5009．5—2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定［S］．

［14］肖懷秋，李玉珍，林親錄，等．冷榨花生蛋白酶解液活性炭脫色工藝的響應(yīng)面優(yōu)化研究［J］．中國(guó)油脂，2014，39（10）：34－38

［15］Montgomery D C．Design and analysis of experiments［M］．Wiley，2008．

［16］肖懷秋，李玉珍，趙謀明，等．二次旋轉(zhuǎn)中心組合響應(yīng)面法優(yōu)化冷榨花生粕脫脂工藝［J］．糧油食品科技，2014，22（6）：33－38．

［17］王威，曾里，曾凡駿．中性蛋白酶提取米渣中大米蛋白的工藝研究［J］．飼料工業(yè)，2008，29（6）：35－37．

Optimization of enzymatic extraction of protein from broken indica rice

LI Yu－zhen XIAO Huai－qiu
（College of Pharmaceutical and Biological Engineering，Hunan Chemical Vocational Technical College，Zhuzhou Hunan 412000）；Pharmaceutical and bioengineering school，Hunan Vocational Technical College of Chemical and Industrial Technology，Zhuzhou Hunan 412000）

To improve protein extraction efficiency from broken indica rice，the technology of extraction of broken indica rice protein extracted by neutral proteinase enzymatic extraction was optimized by central composite design and response surface analysis based on the results of Min－Run Res IV factorial design and steep accent experiment．The second－order polynomial nonlinear regression equation and mathematical model were established．The accuracy of the model was validated．The effects of enzyme loading amount X1，enzymolysis time X2，solid－liquid ratio X3on rice protein extraction rate were analyzed with protein extraction rate and protein purity as the appraisal indexes．The optimum conditions were，enzyme loading amount 0．98%，solid－liquid ratio 1∶10．20，enzymolysis time 74．4 min，pH 7．0 and 50℃．The confirmation experiments were carried out under the optimum conditions，the PER was 89．82% ± 1．06%（n＝3，which was well agreement with the predicted value（91．23%）．The deviation between the measured and predicted condition was－1．55%．The rice protein purity was 81．02%．

broken indica rice protein；neutral proteinase；enzymatic extraction；response surface methodology

TS 210．9

A

1007－7561（2017）02－0022－06

2016－10－8

湖南省教育廳科研項(xiàng)目（16C0550）；湖南省高校科研項(xiàng)目（12C1049）；湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目（HNHY2015 002）．

李玉珍，1981年出生，女，碩士，講師．

肖懷秋，1981年出生，男，碩士，副教授．