川芎嗪對乳腺癌移植瘤小鼠的免疫學(xué)效應(yīng)研究①

汪 悅，柳朝陽，榮光影，宋慶嬌，張 濤

( 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

川芎嗪對乳腺癌移植瘤小鼠的免疫學(xué)效應(yīng)研究①

汪 悅，柳朝陽，榮光影，宋慶嬌，張 濤

( 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:研究川芎嗪對乳腺癌荷瘤裸鼠免疫功能的影響及其抑制腫瘤生長的作用。方法:將40只裸鼠進行分組，分為空白對照組(8只)和模型組(32只)，模型組給裸鼠皮下注射人乳腺癌MCF-7細胞，建立乳腺癌移植瘤模型，空白對照組不做任何處理。將模型組32只裸鼠隨機分為荷瘤對照組和藥物處理組(川芎嗪組、順鉑組、川芎嗪聯(lián)合順鉑組)，每組8只，測定抑瘤率及脾臟指數(shù)；采用酶聯(lián)免疫法檢測川芎嗪對乳腺癌裸鼠免疫抑制因子血清白介素4(IL-4 )及腫瘤壞死因子(TNF-α)表達水平的影響；MTT法檢測脾臟NK細胞殺傷活性。結(jié)果:川芎嗪促使裸鼠抑瘤率及脾臟指數(shù)升高，聯(lián)用組抑瘤率明顯高于川芎嗪單用組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與空白組相比，荷瘤組血清IL-4 及TNF-α表達水平顯著降低；與荷瘤組相比，川芎嗪組及順鉑組血清IL-4 及TNF-α表達水平升高，聯(lián)合組血清IL-4 及TNF-α表達水平顯著升高；與荷瘤對照組比較，川芎嗪組NK細胞活性升高，差異有顯著性意義，且與順鉑聯(lián)用時NK細胞活性顯著提升。 結(jié)論:川芎嗪對小鼠乳腺實體瘤有一定抑制作用，而川芎嗪聯(lián)合化療藥具有協(xié)同促進的治療作用，其機制可能是通過提高小鼠免疫功能從而達到抑制腫瘤生長的效果。

川芎嗪；乳腺癌；脾臟指數(shù)；白介素4；腫瘤壞死因子α；NK細胞殺傷活性

乳腺癌是長期困擾女性健康的惡性腫瘤之一，呈現(xiàn)高復(fù)發(fā)率、高死亡率的特點，目前主要的治療手段仍局限于手術(shù)、放化療方案且無積極有效的預(yù)防措施，放化療嚴重的毒副反應(yīng)及對免疫系統(tǒng)的殺傷作用極大降低了患者的生存質(zhì)量。因此，尋求高效低毒的中草藥協(xié)同治療成為抗乳腺癌的研究熱點[1]。川芎嗪注射液是從中藥單體川芎的生物堿中分離提取有效成分加工制成的滅菌水溶液[2]。前期研究證明川芎嗪對多種腫瘤宿主的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用[3,4]，王[5]等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪對荷瘤裸鼠具有促進和恢復(fù)免疫功能的作用，同時拮抗荷瘤鼠NK活性降低，江[6]研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪既能抑制血管內(nèi)皮細胞的生長、分化，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，又能抑制腫瘤細胞VEGF的表達及VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖。川芎嗪注射液具有清除自由基、抑制某些實體瘤生長及轉(zhuǎn)移、擴張血管等的藥理學(xué)特性，其機制可能與提高機體免疫能力及自然殺傷細胞活性有關(guān)[7～11]，但目前川芎嗪對于MCF-7乳腺癌裸鼠免疫功能的影響尚未見報道。本研究旨在探討川芎嗪對乳腺癌裸鼠免疫功能的影響及其抑制腫瘤生長的作用，為輔助臨床治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料

川芎嗪注射液40mg/2mL；(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司 批號H20003792)；IL-4、TNF-α檢測試劑盒(華美生物工程公司)；MTT粉末(Sigma公司)；紅細胞裂解液(天津灝洋生物制品科技有限公司)；PBS粉末(碧云天生物技術(shù)有限公司)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2 實驗動物

40只SPF級健康雌性4周齡BALB/c-nu裸鼠，20～22g/只，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：scxle( 黑) 2014007。

2 實驗方法

2.1 模型建立及動物分組

將對數(shù)生長期的MCF-7細胞調(diào)至密度為1×107/mL，于裸鼠左前肢腋下皮下注射0.2mL細胞懸液，接種人乳腺癌MCF-7細胞7d后，將接種腫瘤的裸鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：荷瘤模型組、川芎嗪組、順鉑組、川芎嗪聯(lián)合順鉑組，每組8只?？瞻讓φ战M及荷瘤模型組：每日腹腔注射0.9%生理鹽水0.2mL；川芎嗪組：對小鼠進行腹腔注射，使用川芎嗪注射液100mL/kg，連續(xù)給藥20d，每天注射一次；順鉑組：每隔一天給予順鉑注射液2.5mL/kg腹腔注射，總共注射10次；聯(lián)合治療組：川芎嗪注射液100mg/kg，腹腔注射，每天1次，連續(xù)20d，同時，給予順鉑注射液25mg/kg腹腔注射，每隔一天注射一次，連續(xù)10次。

2.2 抑瘤率測定

末次給藥24h后處死實驗小鼠，無菌取出瘤體并稱量濕重，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-實驗組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

2.3 脾臟指數(shù)測定

末次給藥后24h稱重，頸椎脫臼處死，無菌取脾，測量脾臟質(zhì)量。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.4 血清IL-4及TNF-α水平測定

末次給藥24h后腹主動脈取血，待血液自然凝固，室溫條件下，以2000r/min離心時間：20min，分離上清液分裝于1.5mLEP管中，-20℃保存，按照ELISA試劑盒說明書操作進行檢測。

2.5 脾臟NK細胞活性表達的測定

末次給藥24h后，脫頸處死小鼠，無菌取脾置于平皿中加入PBS液，研碎，加入紅細胞裂解液，離心去上清，吹打混勻加入RPMI-1640制備濃度為1×107/mL的脾細胞懸液，將K562作為靶細胞制成濃度為1×105/mL的細胞懸液，以1:1的比例混勻加入細胞培養(yǎng)板，MTT法測定NK細胞活性的吸光度(OD)值。NK細胞活性(%)=[OD靶細胞對照孔-(OD實驗孔 -OD效應(yīng)細胞對照孔)]/OD靶細胞對照孔×100%。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 瘤體質(zhì)量及抑瘤率

與荷瘤對照組相比，川芎嗪治療組瘤體質(zhì)量降低(P<0.05)，順鉑組及川芎嗪聯(lián)合順鉑組的腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，且聯(lián)用組的腫瘤質(zhì)量小于順鉑單用組；聯(lián)用組的抑瘤率明顯高于二者單用組(P<0.01)達到55.63%，提示川芎嗪能一定程度上抑制乳腺實體瘤的生長，且對于化療藥具有協(xié)同增效的作用。

表1 川芎嗪對瘤體質(zhì)量及抑瘤率的影響±s,n=8)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 對脾臟指數(shù)的影響

連續(xù)用藥20d后，川芎嗪組較荷瘤對照組及順鉑組荷瘤鼠脾臟指數(shù)均有上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組脾臟指數(shù)較順鉑組高，但無統(tǒng)計學(xué)意義。提示川芎嗪可能通過增加機體免疫器官的質(zhì)量，增強機體免疫應(yīng)答的能力，提高機體的免疫功能。

表2 川芎嗪對小鼠免疫器官的影響±s,n=8)

與對照組比較，*P<0.05。

3.3 對血清IL-4及TNF-α的影響

與正常組血清IL-4水平相比，模型組血清IL-4含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，川芎嗪組及聯(lián)用組血清IL-4含量明顯升高(P<0.05)。比較血清TNF-α含量差異發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，順鉑組血清TNF-α含量雖有所下降，但差異無顯著性意義(P>0.05)，而川芎嗪組及聯(lián)合組裸鼠血清中TNF-α含量顯著上升(P<0.05)。由此說明，川芎嗪可能通過刺激機體分泌內(nèi)源性免疫因子，抑制乳腺癌的生長、發(fā)展。

表3 川芎嗪對荷瘤小鼠血清IL-4及TNF-α的影響

與對照組比較，*P<0.05。

3.4 對NK細胞活性的影響

與荷瘤對照組比較，川芎嗪組NK細胞活性升高，差異有顯著性意義(P<0.05)，且與順鉑聯(lián)用時NK細胞活性顯著提升(P<0.01)；提示川芎嗪對于小鼠免疫功能提升有促進作用，且能夠拮抗化療造成的免疫功能低下效應(yīng)。

表4 川芎嗪對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響 ±s,n=8)

與對照組比較，*P<0.05。

4 討論

脾臟是機體最大的免疫器官，是T、B淋巴細胞分化成熟的場所，脾臟系數(shù)升高表明T、B淋巴細胞及抗體分泌量的增加，充分發(fā)揮機體細胞免疫與體液免疫的作用，有助于免疫功能的增強[12]。與模型對照組相比，川芎嗪聯(lián)合化療藥組裸鼠脾臟系數(shù)較單用化療組與川芎嗪組明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明川芎嗪可能通過增強宿主免疫功 能抑制腫瘤細胞的生長。

IL-4由Th2型細胞所分泌，主要介導(dǎo)體液免疫，能夠調(diào)節(jié)淋巴細胞的分泌和宿主免疫功能。川芎嗪聯(lián)合化療藥組及川芎嗪組IL-4含量較模型組顯著升高，據(jù)此推斷，川芎嗪可能通過刺激IL-4分泌實現(xiàn)抑制腫瘤生長的效果。川芎嗪聯(lián)合化療藥組的IL-4含量明顯高于川芎嗪組，提示川芎嗪具有一定增強化療效果的作用。TNF-α可誘導(dǎo)細胞凋亡、壞死、血管生成、免疫細胞活化等多種反應(yīng)，已有研究證實，TNF-α通過間接升高腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細胞滲透能力，選擇性破壞腫瘤脈管系統(tǒng)，進而導(dǎo)致腫瘤出血性壞死[13]。相較于模型組，川芎嗪聯(lián)合化療藥組及川芎嗪組血清TNF-α含量顯著上升，與文獻報道一致。

NK細胞具有無需抗原預(yù)先致敏、無需抗體或補體、無MHC限制性、通過血液循環(huán)可直接殺傷某些特定腫瘤細胞的特性，構(gòu)成人體抵御腫瘤侵襲的第一道防線，NK細胞殺傷活性的高低是衡量機體免疫功能強弱的關(guān)鍵因素[14]。川芎嗪聯(lián)合化療藥組的NK細胞殺傷活性明顯高于單用組，說明川芎嗪可能通過提高NK細胞殺傷活性促進免疫功能的恢復(fù)發(fā)揮抗腫瘤的作用。

由此可見，川芎嗪可有效增強乳腺癌荷瘤裸鼠的免疫功能，對化療起到協(xié)同增效的作用，達到抑制腫瘤生長的目的。具體作用機制仍有待深入研究。

[1]孫飛, 張楚, 虞萍,等. 中醫(yī)藥在乳腺癌綜合療法中的地位評價[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2010(8):1275-1280

[2]國家藥典委員會，國家藥品標準.化學(xué)藥品地方標準上升國家標準第8冊[S].277

[3]李萬玉, 徐曉玉, 楊辰鍇. 川芎嗪抗癌作用及其機制的分析[J]. 中國當代醫(yī)藥, 2011, 18(22): 24-25

[4]王文武, 戴西湖, 歐陽學(xué)農(nóng). 川芎嗪對小鼠Lewis肺癌的治療作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2005, 10(04): 421-423

[5]王琪,程德春,王磊.川芎嗪對荷瘤鼠化療后免疫功能的影響[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院報,2003,24(3):243

[6]江金華, 周智鋒, 李潔羽,等. 原發(fā)性肝癌和癌旁組織中NK細胞受體表達及意義[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012, 28(05): 529-532

[7]YangXM.ResearchprogressonthepharmacologicaleffectsofLigustrazine[J].ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics, 2010, 31 (3) : 215-216

[8]RanX,MaL,PengC,etal.LigusticumchuanxiongHort:areviewofchemistryandpharmacology.[J].PharmaceuticalBiology, 2011, 49(11):1180-1189

[9]劉志良. 川芎嗪聯(lián)合順鉑對小細胞肺癌細胞的影響[D]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué), 2009

[10]劉小娟, 章嶸, 楊力,等. 丹參川芎嗪注射液中鹽酸川芎嗪在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)和組織分布研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014, 49(19):1734-1739

[11]PanJ,ShangJF,JiangGQ,etal.Ligustrazineinducesapoptosisofbreastcancercellsinvitroandinvivo[J].JournalofCancerResearch&Therapeutics, 2015, 11(2):454-458

[12]畢愛華.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社，1995：20

[13]VanHorssenR,THT,EggermontAM.TNF-alphaincancertreatment:molecularinsights,antitumoreffects,andclinicalutility[J].Oncologist, 2006, 11: 397-408

[14]羅亞坤, 程燕, 馮玉萍,等. 枸杞多糖對2型糖尿病大鼠免疫功能影響的研究[J]. 中醫(yī)藥信息, 2014, 31(1):13-16

1.黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目，編號：H2015074；2.黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃項目，編號：1252G059；3.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目，編號：201510222026。

汪悅(1990～)女，湖北黃石人，在讀碩士研究生。

張濤(1971～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：961836085@qq.com。

R

A

1008-0104(2017)01-0031-03

2015-11-20)