灌服杜仲對牙移動中破骨細(xì)胞的作用①

王 洋，李善昌

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 ，黑龍江 佳木斯 154002)

灌服杜仲對牙移動中破骨細(xì)胞的作用①

王 洋，李善昌

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 ，黑龍江 佳木斯 154002)

目的:研究中藥杜仲在大鼠牙移動中牙周組織改建中的作用機(jī)制及其對破骨細(xì)胞的影響。方法:選取32只SPF級Wistar雄性大鼠，建立大鼠正畸牙齒移動實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停S機(jī)分為對照組和杜仲組，每組16只，杜仲組每天灌服鹽杜仲1mL，對照組每天灌服等量的生理鹽水，2組動物均于正畸加力后7,14,21,28d時分批次處死，每批處死4只。分離大鼠的上、下頜骨，測量牙齒移動的距離，同時制作上頜第一磨牙區(qū)牙周組織切片，光鏡觀察，免疫組織化學(xué)檢測RANKL的表達(dá)并利用PASWstatisticsl8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。結(jié)果:杜仲組大鼠牙齒近中移動距離明顯大于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05))。光鏡顯示，杜仲組牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于對照組，與對照組有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論:杜仲能促進(jìn)大鼠正畸牙移動過程中破骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)牙槽骨吸收及牙槽骨重建，有利于正畸牙齒移動。

鹽杜仲；正畸牙移動；破骨細(xì)胞；RANKL

牙齒矯正不僅可以改善咬合關(guān)系,提高咀嚼效率,還可以改善外貌預(yù)防齲齒和牙周病，因?yàn)檫@些優(yōu)點(diǎn)，許多青少年和成人選擇了正畸。但同時也存在療程長、復(fù)診間隔時間長、易患齲病牙周病的缺點(diǎn)。為了克服這些缺點(diǎn)，許多國內(nèi)外學(xué)者對縮短矯治時間提高矯治速度進(jìn)行了研究[1]。目前，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)能夠加快正畸牙移動的外源性因素主要有激素、中藥、細(xì)胞因子以及物理方法(激光、磁場、超聲波等)四大類[2]。杜仲其味甘，性溫。因具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨和固經(jīng)安胎等功效，常在臨床上使用。因此，本實(shí)驗(yàn)選取杜仲進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對牙槽骨改建的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：選擇32只8周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),體質(zhì)量190～220g。 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心清潔級動物室， 自由進(jìn)食固體飼料(消毒) ，飲用消毒清水(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，室溫控制在18～25℃。

1.1.2 鹽杜仲“棕色樣微細(xì)顆粒制劑,每袋1g,華潤三九醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號1408001S。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ簩?shí)驗(yàn)動物用4%水合氯醛0.5mL/100g對大鼠進(jìn)行腹腔注射，將大鼠頭和四肢固定在實(shí)驗(yàn)臺上。確定大鼠右側(cè)上頜第一磨牙為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)為對照組。用一根直徑為0.25mm的結(jié)扎絲穿過大鼠右側(cè)上頜第一磨牙和第二磨牙間，連接一根直徑0.012cm、4mm左右長的鎳鈦螺旋彈簧。在慢速牙科手機(jī)上安裝刃狀金剛砂磨頭，在兩上頜中切牙延頸緣在唇舌面、近中和遠(yuǎn)中舌線角的牙頸部各磨出深約0.5mm的牙釉質(zhì)，形成一連續(xù)的固位溝。用一根直徑為0.20mm的結(jié)扎絲嵌入溝內(nèi)，將兩上頜中切牙連成一整體。正畸測力計測量Ni-Ti拉簧拉力力值均為50N，以兩上頜中切牙為支抗?fàn)坑覀?cè)上頜第一磨牙向近中移動。最后，在上頜兩中切牙環(huán)扎結(jié)扎絲的唇頰舌面上，清潔后用玻璃離子黏結(jié)劑將兩上頜中切牙黏結(jié)固定，即可防止加力裝置脫落同時又可以增強(qiáng)支抗。從實(shí)驗(yàn)開始到結(jié)束整個過程中忽略支抗喪失。隔天開始檢查加載裝置，一旦加力裝置脫落立刻重新安裝加載裝置。每周同一時間加力一次。 每次加力時均用正畸測力計測量鎳鈦拉簧拉力值為50N。

1.2.2 灌服藥物：實(shí)驗(yàn)組的大鼠與建模當(dāng)天開始灌位鹽杜仲(杜仲按照每包灌胃10只大鼠計量，每日一次)，對照組灌胃同等劑量的生理鹽水，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.3 牙齒移動距離測量

大鼠于建立大鼠正畸牙齒移動模型開始后7、14、21及28d分批處死，實(shí)驗(yàn)組和對照組各4只，分離大鼠上下頜骨，取右側(cè)上頜第一磨牙及牙周組織，游標(biāo)卡尺測量右側(cè)上頜第1磨牙遠(yuǎn)中面與第2磨牙近中面之間距離，為大鼠牙齒正畸移動距離。每例標(biāo)本均反復(fù)測量5次，取平均值。

1.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備

取上頜骨于多聚甲醛中固定，10%EDTA脫鈣3個月。石蠟包埋后，沿著牙長軸，近遠(yuǎn)中向連續(xù)切片，切成約5μm厚的連續(xù)切片[3]。蘇木素一伊紅(HE)染色、以及用免疫組化方法觀測牙周組織內(nèi)RANKL的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 牙齒移動距離

正畸加力后7、14、21、28d，杜仲組右側(cè)上頜第一磨牙的近中移動距離明顯大于對照組，見表1。隨著時間的延長，杜仲組均大于對照組且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 大鼠正畸牙移動距離±s,mm)

2.2HE染色觀察結(jié)果

加力7d后，可在組織切片中觀察到實(shí)驗(yàn)組壓力側(cè)牙槽骨吸收大量破骨細(xì)胞活躍。在壓力側(cè)牙周組織中，破骨細(xì)胞胞漿豐富，胞核聚集，核仁清晰，形成吸收陷窩，牙周血管擴(kuò)張，牙周纖維排列紊亂。隨著時間延長，破骨細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，壓力側(cè)出現(xiàn)深而廣泛不規(guī)則的吸收陷窩，呈蠶蝕狀，附近的牙槽骨形成大量骨吸收陷窩，可見破骨細(xì)胞活動。對照組與實(shí)驗(yàn)組時相比破骨細(xì)胞數(shù)目少，骨吸收陷窩小。

圖1 牙周組織切片(蘇木精-伊紅×200)

2.3RANKL表達(dá)

RANKL陽性表達(dá)可定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，主要位于牙周膜，牙骨質(zhì)以及骨吸收陷窩內(nèi)的破骨細(xì)胞中。壓力側(cè)牙槽骨中RANKL的表達(dá)水平隨時間的增加而增加，隨著時間增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)[4]。

圖2 免疫組化切片(RANKL染色×200)

3 討論

隨著科技的發(fā)展，越來越多的方法被研究出來加快牙齒移動速度，加快骨改建，但均有許多副作用，在臨床使用較少。中藥具有安全、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，無論青少年還是成年人均可服用，因此越來越多的中藥用于研究對牙槽骨改建的作用。中醫(yī)認(rèn)為骨、齒與腎的功能緊密相連，根據(jù)這個理論，“補(bǔ)骨強(qiáng)腎”功效的中藥在骨改建過程中起到一定促進(jìn)作用，因此有許多此類中藥對于牙槽骨改建的相關(guān)研究，例如丹參、川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)等?！侗静菥V目》中記載杜仲“色紫而潤，味甘微辛，其氣溫平，甘溫能補(bǔ)，微辛能潤，故能入肝而補(bǔ)腎”。現(xiàn)代研究表明杜仲不僅可以降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化等作用，還證明杜仲可以加強(qiáng)人體細(xì)胞物質(zhì)代謝，防止肌肉骨骼老化，調(diào)節(jié)骨代謝、抗骨質(zhì)疏松的作用。

牙齒在正畸力的作用下移動主要依靠的是牙槽骨的改建，牙槽骨改建是以骨的吸收和形成來玩完成的，即壓力側(cè)骨吸收張力側(cè)骨形成。在需要改建的部位有破骨細(xì)胞貼附，破骨細(xì)胞吸附后會分泌蛋白酶和酸性物質(zhì)，這些酸性物質(zhì)和蛋白酶會溶解吸附部位的骨基質(zhì)及礦物質(zhì)，這時吸附部位的骨組織就會形成蠶食狀骨吸收陷窩，成骨細(xì)胞會移行至吸收陷窩內(nèi)，然后分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)進(jìn)一步礦化進(jìn)就形成了新骨。

RANKL與其受體RANK結(jié)合對驅(qū)動破骨細(xì)胞從造血前體細(xì)胞的發(fā)育并活化為成熟的破骨細(xì)胞提供了關(guān)鍵的信號[5]。成骨細(xì)胞表達(dá)的OPG和破骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL的平衡決定了破骨作用[6]。當(dāng)OPG與RANK結(jié)合增多時，破骨細(xì)胞數(shù)目減少，成骨細(xì)胞增多。當(dāng)RANKL與RANK結(jié)合增多時，破骨細(xì)胞數(shù)目增加。Sasak體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OPG和RANKL對破骨細(xì)胞的終末分化有重要的調(diào)節(jié)作用。Boabaid證實(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞可以通過表達(dá)OPG和RANKL，進(jìn)而調(diào)節(jié)破骨質(zhì)細(xì)胞生成來完成骨改建。經(jīng)多年來實(shí)驗(yàn)研究表明，具有刺激RANKL表達(dá)的因子有白細(xì)胞介素1L-1、前列腺素、甲狀旁腺激素等，中藥有金盞花、丹參、骨碎補(bǔ)等[7]。在實(shí)驗(yàn)過程中，杜仲組移動距離均大于實(shí)驗(yàn)組。RANKL的表達(dá)隨時間增加而表達(dá)逐漸增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)說明杜仲可以促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖，使破骨細(xì)胞數(shù)增多，加快牙齒移動。杜仲能加快正畸牙齒移動，其主要原因是在正畸力的作用下使壓力側(cè)牙周組織中破骨細(xì)胞的數(shù)目增多和骨吸收功能增強(qiáng)，而RANKL是在骨代謝中對破骨細(xì)胞的形成和分化起主要調(diào)節(jié)作用的因子[8]。RANK與RANKL在體內(nèi)的一個最重要的作用就是通過破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)骨改建[9]。因?yàn)镽ANKL是對破骨細(xì)胞的形成和分化起主要調(diào)節(jié)作用的因子[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明鹽杜仲組牙齒移動速度、破骨細(xì)胞數(shù)目活性均高于對照組，可以加快牙齒移動，為臨床加快牙齒移動、提高矯治速度、縮短療程提供了理論依據(jù)。

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The effects of eucommia ulmoides Oliver on orthodontic tooth movement in rats

WANGYang,LIShan-chang

(Collage of Pharmacy in Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To research the effects and mechanism of feeding Eucommia ulmoides Oliver orthodontic on periodontium remodeling in tooth movement in rats. Methods: 32 rats were divided into two groups randomly. Orthodontic; coil spring was fixed between the maxillary first molar and the two central incisors. The experimental group were fed with 1ml eucommia ulmoides Oliver orthodontic while the control group were fed with normal Nacl 1ml every day. The two groups of rats were executed in batches on the 7th, 14th, 21th, and the 28th days. The mandible of rats were separated, and the distance of tooth movement was measured. At the same time the maxillary first molar area periodontal tissue biopsies were produced. Light microscopy was used for observation. The immunohistochemical was used to detect RANKL expression. And PASW statistics l8 software was used for data processing, t test and variance analysis. Results: The teeth mobile distance in Eucommia ulmoides Oliver group was significantly greater than the control group, and the difference has statistical significance (P<0.05).Lightmicroscopyshowedthatthenumberofsaltgroupofosteoclastinperiodontaltissueofthebarkofencomiawasobviouslygreaterthanthecontrolgroupandthedifferenceswerestatisticallysignificance(P<0.05). Conclusion: Eucommia ulmoides Oliver can accelerate the orthodontic tooth movement in rats proliferation and differentiation of osteoclasts,alveolar bone absorption and alveolar bone reconstruction and, which is good for orthodontic tooth movement.

eucommia ulmoides Oliver orthodontic; tooth movement; osteoclast; RANKL

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目，編號：12521553。

王洋(1989～) 女，黑龍江北安人,在讀碩士研究生。

李善昌(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E- mail：1004078333@qq.com。

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1008-0104(2017)01-0020-03

2015-12-07)