雙參口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

馬麗文，宋琳琳，胡曉艷，胡曉冬，駱宇鑫，張 潔

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

雙參口服液的研制及其抗氧化作用的研究①

馬麗文，宋琳琳，胡曉艷，胡曉冬，駱宇鑫，張 潔

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討研制雙參口服液的最佳制備工藝及多糖含量測定，并研究多糖體外抗氧化性。方法：用正交試驗法進(jìn)行制備工藝的研究，并對雙參口服液的多糖進(jìn)行含量測定以及體外抗氧化性的研究。結(jié)果：雙參口服液研制的最佳超聲提取工藝為：樣品比例為2:1:2(玉竹:沙參:黨參)，超聲時間為50min，超聲溫度為60℃時，多糖的提取率最高。用苯酚-濃硫酸法測定樣品多糖的平均含量為15.90%。在體外抗氧化活性實驗中，雙參口服液中的多糖在一定濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基和·OH自由基有清除能力。結(jié)論：雙參口服液中的多糖采用超聲波提取法是可行的并且含量較高，雙參口服液中的多糖具有很好的體外抗氧化活性。

雙參口服液；多糖；超聲提??；抗氧化活性

雙參口服液是由玉竹、沙參、黨參配伍而成，玉竹為百合科黃精屬植物玉竹(Polygonatumodoratum(Mill)Druce)的干燥根莖，該植物含有各種豐富的甾體皂苷[1]、多糖、氨基酸等化學(xué)成分，是一種生理活性顯著且極具開發(fā)利用價值的植物資源。多糖在玉竹中含量較高，玉竹多糖具有抗氧化[2]、強(qiáng)心、降血脂、降血糖等作用。黨參(CodonopsispilosulaFranchNannf)為多年生草本植物，屬桔?？疲幱酶稍锔?。黨參主要成分為多糖、黃酮以及生物堿等成分。黨參多糖化合物在黨參中具有很強(qiáng)的生物活性，黨參多糖能起到降低血壓、降低血糖血脂、抗衰老[3]、抗腫瘤[4]等多種作用。沙參(AdenophorastrictaMiq)多年生草本植物，屬桔?？?。北沙參的化學(xué)成分主要包括多糖、香豆素類、三萜酸、氨基酸等成分。沙參多糖具有祛痰作用、抗真菌作用、強(qiáng)心作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明自由基與許多疾病的發(fā)生、惡化以及有機(jī)體的衰老過程密切相關(guān)[5]。本研究以玉竹、黨參、沙參為原料，對它們的活性多糖成分進(jìn)行超聲提取[6～8]，在此基礎(chǔ)上研發(fā)出雙參口服液，該產(chǎn)品的研發(fā)對促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極作用。

1 實驗材料

1.1 藥材來源

玉竹、沙參、黨參等藥材購于黑龍江省佳木斯市藥店。

1.2 材料

儀器：KDM電加熱套(山東省甄誠環(huán)宇科研儀器廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(西安匯鴻環(huán)?？萍加邢薰?；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TJ82-3電動離心沉淀機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；FA2004電子分析天平(徐州彭宇電子儀器有限公司)；UV-757紫外可見分光光度計(北京譜析通用)；試劑：化學(xué)試劑均為分析純；無水乙醇(北京化工廠)；濃硫酸(北京化工廠)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；水楊酸(廣州溫聯(lián)化工有限公司)；DPPH(北京豪爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 雙參口服液的研制

為優(yōu)化提取工藝條件，制定正交實驗方案，本實驗采取三因素三水平的正交實驗，以確定最佳工藝條件，選用因素及水平見表1。按照所選取的比例稱取三種藥材共90g，將藥材浸泡12h后，進(jìn)行超聲提取，過濾，共提取2次，將2次濾液合并，濾液移至500mL燒杯中，將其濃縮到原來體積的三分之一，冷卻，加入200mL95% 的乙醇溶液，邊加邊攪拌，然后靜置12h，之后將上層濾液倒入回收瓶里以備回收。將下層沉淀中殘余的乙醇揮發(fā)掉，然后將沉淀放在烘箱中105℃烘干。精密稱量干燥的樣品。見表1。

多糖提取率(%)=多糖PoPs(mg)/樣品質(zhì)量(mg)×100%。

表1 正交實驗影響因素水平表

2.2 雙參口服液多糖的含量測定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖10mg，加蒸餾水溶解后并定容至100mL容量瓶中，搖勻，即配制得0.1mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的樣品10mg，加水溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別放置于10mL干燥的具塞試管中，加入蒸餾水至2.0mL，搖勻。再分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入5mL濃硫酸，搖勻，微振5min。放置5min后，置于沸水浴中加熱15min，然后取出，冷卻至室溫(25℃)。另外取一只10mL的具塞試管，以蒸餾水2.0mL按如上同樣操作后作為空白對照，于最大吸收波長處(490nm)測定吸光度。同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)測定3次,取平均值。以葡萄糖濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 雙參口服液中多糖含量的測定

精密稱取各批次供試品液2.0mL，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項下的自“加5%苯酚溶液”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中多糖的濃度。

多糖的含量(%)=(C樣×100/10000)×100% (C樣為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品濃度)

2.3.1 對·OH自由基清除作用

[9],取1.0mL0.15mol·mL-1pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，1.0mL40μg·mL-1番紅花紅溶液，0.945mmol·mL-1EDTA-Fe(Ⅱ)(新配)溶液1.0mL，0.5mL不同濃度的雙參口服液多糖溶液、3%H2O2溶液1.0mL(新配)，在37℃水浴中加熱30min后在520nm處測定吸光度A樣。空白組以0.5mL水代替樣品測定吸光度A0。對照組以1.5mL蒸餾水代替H2O2和樣品測定吸光度A，用3.5mL蒸餾水代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品，并和1.0mL磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行調(diào)零。清除率%=(A樣-A0)/(A-A0)×100%。

2.3.2 對DPPH·的清除能力

樣品與抗氧化劑預(yù)期作用模式為AH+DPPH·→DPPH-H+A，準(zhǔn)確稱取10mgDPPH，用50%乙醇定容至250mL容量瓶中，配得0.1mmol/L的DPPH溶液。見表2。

表2 DPPH·實驗加樣表

樣品對DPPH·自由基的清除能力(scavengingactivity，SA)可表示公式為

SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

3 結(jié)果

3.1 雙參口服液的最佳制備工藝

見表3。

表3 雙參口服液正交實驗提取結(jié)果

對上表進(jìn)行直觀分析可知，極差大小顯示各因素的影響作用依次為A>C>B，即樣品之間的比例>超聲溫度>超聲時間。雙參口服液研制的最佳超聲提取工藝為A3B3C2，即最佳提取工藝為樣品比例2:1:2，超聲溫度為60℃，超聲時間為50min。

3.2 雙參口服液多糖的含量測定

3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在490nm處測定吸光度A值。橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度(C)，縱坐標(biāo)為吸光度(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程為y=0.0102x+0.088，R2=0.9932。

3.2.2 雙參口服液中多糖的含量測定

見表4。

表4 雙參口服液多糖的含量測定(n=9)

經(jīng)計算，求得供試品中多糖的平均含量為15.9%。

3.3 雙參口服液的體外抗氧化性研究

3.3.1 對·OH自由基清除作用

取不同濃度的雙參口服液中的多糖溶液測定其多糖對·OH的清除作用。

由圖2所知，不同濃度的雙參口服液中的多糖對·OH具有一定的清除作用，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，即雙參口服液中多糖濃度越大，對羥自由基的清除率越大。樣品在5～17.5mg·mL-1時，雙參口服液中的多糖清除羥自由基能力迅速提高，當(dāng)樣品濃度達(dá)到17.5mg/mL以后，清除羥自由基能力上升緩慢。各個樣品在試驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。見圖2。

圖2 雙參口服液對·OH的清除能力

3.3.2 對DPPH·的清除能力

取不同濃度的雙參口服液中的多糖溶液測定其多糖對DPPH·的清除作用。見圖3。

圖3 雙參口服液對DPPH·的清除能力

不同濃度的雙參口服液多糖提取物樣品清除DPPH自由基的能力如圖3所示。當(dāng)樣品達(dá)到一定濃度時所有樣品的DPPH自由基清除能力均提高迅速，之后增長趨勢趨于緩慢，它們的DPPH自由基清除能力呈劑量依賴性，隨著濃度的逐漸增加其自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。

4 討論

雙參口服液是由玉竹、沙參、黨參配伍而成， 采用超聲等工藝提取，配制而成的中藥復(fù)方制劑口服

液，具有降血壓、降血脂之功效，為了使產(chǎn)品的質(zhì)量得以保證，本論文采用正交實驗法，系統(tǒng)地考察了樣品之間的比例、超聲溫度、以及超聲時間對口服液多糖提取率的影響，并用苯酚硫酸法測定多糖的含量，摸索出制備工藝的最佳條件為樣品比例為2:1:2(玉竹:沙參:黨參)，超聲時間為50min，超聲溫度為60℃時，多糖的提取率最高。雙參口服液提取物多糖對清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效關(guān)系，而且雙參口服液多糖在一定濃度范圍內(nèi)清除·OH、DPPH·自由基效果隨雙參口服液提取物多糖濃度的增加而加強(qiáng)。

綜上所述，雙參口服液多糖的提取采用超聲波提取法，工藝合理，含量較高，并且雙參口服液提取物多糖對清除·OH自由基、DPPH·自由基均有一定的量效關(guān)系，將作為一種抗氧化新藥為人類的健康作出貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

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[2]寧慧,李會寧,楊培君,等. 玉竹多糖的抗氧化作用研究[J]. 陜西理工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 29(26):59-65

[3]宋琳琳,李懷荊. 冬奇子口服液抗衰老的實驗研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2010,33(6): 24-25

[4]楊瑾, 劉杰書, 袁德培. 板橋黨參多糖體內(nèi)抗腫瘤活性實驗研究[J]. 中國處方藥, 2014,12(3): 25-26

[6]JiH,ShaoH,ZhangC,etal.SeparationofthepolysaccharidesinCaulerparacemosaandtheirchemicalcompositionandantitumoractivity[J].JournalofAppliedPolymerScience, 2008, 110(3):1435-1440

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Preparation of ShuangShen oral liquid and studies on its antioxidant effect

MALi-wen,SONGLin-lin,HUXiao-yan,HUXiao-dong,LUOYu-xin,ZHANGJie

(School of Pharmacological Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Objective: To explore the optimum ultrasonic extraction techniques for ShuangShen oral liquid and the determination of polysaccharide, and to study the antioxidant activity of polysaccharideactivity in vitro. Methods: The orthogonal experiment was used to study the extractive techniques, and to observe the influence of the ratio between samples, ultraphonic time and ultraphonic temperature on the extractive efficiency of polysaccharide. The contents of extraction of polysaccharide were determined by phenol-sulfuric acid method. The study of polysaccharide activity in vitro was used to observe the scavenging activity of ·OH and DPPH·. Results: The optimum extraction technology of ShuangShen oral liquid is that the ratio between samples was 2:1:2 (polygonatumodoratum: adenophora: codonopsis pilosula); the ultrasonic temperature was 60℃; and ultrasonic time was for 50min. The ratio of extraction of polysaccharide was at the highest levels. The determination of polysaccharides content of the sample determined by phenol-sulfuric acid method was 15.90%. In the experiment of antioxidant activity in vitro, the polysaccharide of ShuangShen oral liquid in a certain concentration range could remove ·OH and DPPH. Conclusion: The polysaccharide of ShuangShen oral liquid extracted by ultrasonic method is feasible. The determination of polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method is accurate and reliable. The polysaccharide in ShuangShen oral liquid has the ability to remove ·OH and DPPH· , and the scavenging capacity is proportional to the concentration. And it has good antioxidant activity.

ShuangShen oral liquid; polysaccharide; ultrasonic extraction; antioxidative activity

1.國家自然科學(xué)基金，編號：21271089；2.黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目，編號：201510222036；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項目，編號：13Z1201561。

馬麗文(1995～)女，黑龍江哈爾濱人，在讀本科學(xué)生。

宋琳琳(1982～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail：linlin19822891@163.com。

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A

1008-0104(2017)01-0006-03

2016-12-10)