大田苦瓜的離體快繁研究

吳 蓓，戴修純，鄭巖松，張木清，李光光，陳勝文，劉紹欽

（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510335）

苦瓜（Momordica charantia Linn.）為葫蘆科苦瓜屬1年生或2年生攀援草本植物［1］。其諸多保健功能得到人們的高度重視，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證明，苦瓜具有降低血糖、抗腫瘤以及提高人體免疫力等作用［2］。喜食苦瓜的人群越來越多，苦瓜栽培面積和范圍越來越大，現(xiàn)在苦瓜在很多地區(qū)已成為主要蔬菜種類之一，特別是在華南地區(qū)，苦瓜已成為最重要的瓜類作物之一。隨著苦瓜食用、藥用價值的開發(fā)，對其優(yōu)良品種的需求越來越大。目前，人們普遍認識到雜種優(yōu)勢利用是提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆、抗病等性狀最有效的方法［3-4］，但育成苦瓜雜交種需要經(jīng)歷親本多代自交純化［5］，費時費工，而為了提高苦瓜的育種效率，可以將具有不同性狀優(yōu)點的育種材料的F1代種子直接進行雜交，得到具有不同基因型的F2代種子，在大田中觀察F2代種子長出來的植株表現(xiàn)，選取綜合性狀優(yōu)良的植株進行組培育苗，以保持其母體植株的生物學(xué)特性和遺傳性狀，生產(chǎn)出性狀高度一致的種苗。鑒于此，本研究選取不同取材時間（包括大田已結(jié)成熟瓜的頂芽和側(cè)芽作為外植體）、不同激素類型及配比組合對苦瓜誘導(dǎo)不定芽形成、芽增殖以及不定根形成的影響，建立了大田苦瓜的離體再生體系。這將是蔬菜品種創(chuàng)新中有意義的一項技術(shù)革新，可為其他蔬菜育種工作提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2016年3月在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院南沙展示基地種植的苦瓜F1代商品種碧豐3號和選育的大頂雜交品種單株（編號SDZ-36）的頂芽和側(cè)芽為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒時間對接種污染率的影響 分別選取碧豐3號和SDZ-36的株齡15 d、30 d和已結(jié)成熟商品瓜的苦瓜枝條，去除表面污垢后切成帶芽的節(jié)段，在流水下沖洗10 min，然后在超凈工作臺上進行表面滅菌。先用75%乙醇浸泡30 s、無菌水沖洗3～4遍，然后用0.1%升汞進行消毒處理（消毒時間設(shè) 3、5、7、9、11 min），再用無菌水沖洗5～6次，最后接種在MS基本培養(yǎng)基上，置于溫度26（±2）℃、空氣相對濕度為60%左右、光照強度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d的條件下培養(yǎng)。MS基本培養(yǎng)基均含3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH為5.7～5.8，121℃高壓滅菌20 min。每個品種各取30個節(jié)段，即每個處理共60個節(jié)段，每瓶接種1個節(jié)段，3次重復(fù)。接種后10～15 d統(tǒng)計污染率，比較不同消毒時間對消毒效果的影響，計算公式為：

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響 將上述消毒好的不同生長階段的苦瓜枝條節(jié)段外植體接入以下4種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)：MS+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.7 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L、MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。每個品種各取30個節(jié)段，即每個處理共60個節(jié)段，每瓶接種1個節(jié)段，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同

1.2.1 。接種28 d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率，比較不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，計算公式為：

1.2.3 增殖培養(yǎng)基對不定芽增殖的影響 將誘導(dǎo)28 d后分化出的苦瓜不定芽轉(zhuǎn)入以下10種增殖培養(yǎng)基中：MS+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.7 mg/L、MS+6-BA 0.7 mg/L+IAA 0.7 mg/L、MS+6-BA 0.7 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L、MS+6-BA 0.3 mg/L+IAA 0.3 mg/L、MS+6-BA 0.3 mg/L、MS+6-BA 0.1 mg/L。每個處理10瓶，每瓶接種4株，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.1，28 d后調(diào)查不定芽的增殖情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)基對生根效果的影響 切取伸長的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，可促進不定芽生根長成完整的植株。生根培養(yǎng)基設(shè)以下6個處理：MS+IBA 0.5 mg/L、MS+IBA 0.3 mg/L、MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.5 mg/L、1/2MS+IBA 0.3 mg/L、1/2MS+IBA 0.1 mg/L。每個處理10瓶，每瓶接種4株，3次重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.1，8 d后觀察不同培養(yǎng)基下苦瓜不定芽的生根天數(shù)、根長及根的質(zhì)量對組培苗移栽成活率的影響。

1.2.5 組培苗的田間培育 苦瓜組培苗的不定芽在生根培養(yǎng)基的瓶中培養(yǎng)若干天后，至一定的根長及數(shù)量時，移至有自然光照、溫度為28（±2）℃的煉苗棚煉苗3～5 d，再移栽至有營養(yǎng)土的杯中育苗，至苗高15 cm以上后移至大田栽培。初步觀察比較組培苗和實生苗的長勢情況以及果實外觀性狀（如瓜形、瓜色、瘤狀）和口感是否改變。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對苦瓜外植體接種污染率和不定芽誘導(dǎo)率的影響

消毒時間對不同生長階段（株齡15 d、株齡30 d和已結(jié)成熟商品瓜）的苦瓜外植體接種污染率和不定芽誘導(dǎo)率的影響見表1。由表1可知，株齡15 d的苦瓜外植體，當(dāng)0.1%升汞消毒時間為5 min時，污染率很低（0.1%），而不定芽誘導(dǎo)率很高（94.8%）；當(dāng)0.1%升汞消毒時間大于7 min時，外植體容易死亡，因此升汞消毒時間以5 min最佳。株齡30 d和已結(jié)成熟商品瓜的外植體，當(dāng)1%升汞消毒時間為7 min時，污染率均低于1%，不定芽誘導(dǎo)率均高于90%；1%升汞消毒時間在9 min以上時，外植體容易死亡，因此升汞消毒時間以7 min為佳。

表1 消毒時間對苦瓜外植體接種污染率和不定芽誘導(dǎo)率的影響

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對苦瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

表2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對苦瓜不定芽誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，不同株齡的苦瓜外植體均能很好地在4種激素組合的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出不定芽，不定芽誘導(dǎo)率均在80%以上。但外植體株齡越長，其誘導(dǎo)出芽所需時間越長，出芽時間均在7～15 d之間。據(jù)觀察，當(dāng)激素濃度較

高時，愈傷組織出現(xiàn)率會增加，由于愈傷組織會增加組培苗的變異率，因此MS+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.7 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L不予采用，MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L中激素濃度太低，雖然能降低愈傷組織出現(xiàn)率，但也使不定芽誘導(dǎo)所需時間延長，因此選取MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)各生長階段的外植體不定芽最為合適（圖1，彩插二）。

圖1 MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.3 mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d的不定芽

2.3 增殖培養(yǎng)基對苦瓜不定芽增殖的影響

影響苦瓜組培苗擴大生產(chǎn)的關(guān)鍵問題之一是誘導(dǎo)的不定芽增殖時容易出現(xiàn)愈傷組織，而由愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽的變異率很高，為保持選育出的苦瓜品種的優(yōu)良性狀，我們將盡量避免愈傷組織的出現(xiàn)。將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)入附加適宜濃度激素的培養(yǎng)基中，可以促進不定芽的增殖。由于外植體的取材時間會影響前期不定芽的誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)率，因此，在擴大生產(chǎn)苦瓜組培苗時，通常只取株齡15 d的外植體節(jié)段作為試材。而在需要進行品種選育時，必須從已結(jié)瓜的苦瓜植株上取外植體進行培育。從表3可以看出，MS+6-BA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中不定芽增殖系數(shù)較大，且愈傷組織出現(xiàn)率最小，是苦瓜不定芽增殖最適培養(yǎng)基（圖2，彩插二）。

表3 增殖培養(yǎng)基對苦瓜不定芽增殖的影響

圖2 MS+6-BA 0.1 mg/L增殖培養(yǎng)21 d不定芽增殖情況

2.4 生根培養(yǎng)基對苦瓜不定芽生根效果的影響

在誘導(dǎo)苦瓜組培苗不定芽生根時，需選擇合適的培養(yǎng)基和激素配比，否則容易出現(xiàn)泡沫根，降低組培苗成活率。表4顯示，隨著激素濃度的降低，誘導(dǎo)出的不定根出現(xiàn)泡沫根越少，而當(dāng)MS培養(yǎng)基換成1/2MS時，泡沫根出現(xiàn)比例提高，其中MS+IBA 0.1 mg/L較適合誘導(dǎo)苦瓜不定根。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，在MS+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)8 d后都開始產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)15 d后不定根長度達到4～5 cm，此時組培苗的成活率最高，培養(yǎng)22 d后出現(xiàn)泡沫根的比例在50%以上，組培苗成活率極低（表5）。因此，選用MS+IBA 0.1 mg/L為不定根培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d后移至營養(yǎng)杯中為最適種植條件（圖3，彩插二）。

表4 不定根誘導(dǎo)15 d后生根培養(yǎng)基對苦瓜生根效果的影響

2.5 苦瓜組培苗的田間培育

苦瓜組培苗的不定芽在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，當(dāng)根數(shù)5～6條、根長4～5 cm時，將其移至有自然光照、溫度28（±2）℃的大棚中煉苗3～5 d，再移至有營養(yǎng)土的杯中育苗，至苗高15 cm以上后可移至大田栽培。初步發(fā)現(xiàn)，在同樣的栽培條件下，苦瓜組培苗在長勢方面不如種子苗（圖4～圖7，彩插二），但是其果實外觀性狀（如瓜形、瓜色、瘤狀情況和口感等）與種子苗無異（圖8～圖9，彩插二），且具有提早成熟、整齊度高等優(yōu)點。

表5 不定根誘導(dǎo)時間對苦瓜組培苗成活率的影響

圖3 MS+IBA 0.1 mg/L培養(yǎng)15 d的生根苗

圖4 碧豐3號苦瓜組培苗

圖5 碧豐3號苦瓜種子苗

圖6 大頂苦瓜組培苗（SDZ-36）

圖7 大頂苦瓜種子苗

圖8 碧豐3號苦瓜組培苗（左）和種子苗（右）所結(jié)果實

圖9 大頂苦瓜所結(jié)果實

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)的初代培養(yǎng)外植體取自自然生長的植物，都帶有各種各樣的微生物，只有對這些材料進行成功消毒，才是建立起高效組培系統(tǒng)的第一步。而不同生長階段的外植體，由于其老嫩不同，所帶微生物程度不同，所需的消毒時間也不同，因此，找出適合不同生長階段外植體的合適消毒時間對組培系統(tǒng)的建立非常重要［6］。本研究結(jié)果表明，為了大量生產(chǎn)苦瓜組培苗，可以取株齡15 d內(nèi)的苦瓜苗頂芽或側(cè)芽，這些外植體生長時間短，較為幼嫩，帶菌較少，因此0.1%升汞消毒控制在5 min能達到很好的消毒效果。

目前苦瓜采用常規(guī)雜交育種方法得到純化的父本母本需要5年以上的時間［7］，而為了提高苦瓜的育種效率，可以把具有不同性狀優(yōu)點的育種材料的F1代種子直接進行雜交，其F2代就是具有不同基因型的雜合體種子群體，這個群體保持了極豐富的表現(xiàn)性狀，我們就可以通過在大田中對其進行大量的觀察篩選，從中直接選擇綜合性狀優(yōu)良的植株進行組培育苗，因此試驗中必須選取已結(jié)成熟商品瓜的植株頂芽或側(cè)芽作為外植體。而種子萌發(fā)30 d后直至結(jié)出成熟商品瓜的材料帶內(nèi)生菌較多，消毒難徹底，但外植體較成熟，能承受更長的消毒時間，因此0.1%升汞消毒時間控制在7 min左右為宜。

研究苦瓜不定芽的誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，愈傷組織非常容易形成，與前人結(jié)論［8-12］是一致的。但由于愈傷組織的分化能力與品種基因型等因素有關(guān)［13］，且通過愈傷組織分化得到的組培苗變異率更高，不適合用于苦瓜組培苗的生產(chǎn)和苦瓜育種。因此，我們適當(dāng)降低外源激素濃度以減少愈傷組織的產(chǎn)生。在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中，不定芽能否順利被誘導(dǎo)與培養(yǎng)基中外源激素的濃度有很大關(guān)系，而不同生長階段的外植體均能被很好地誘導(dǎo)，只是生長時間越長的材料誘導(dǎo)不定芽所需時間稍長。在不定芽的增殖階段，繼續(xù)降低外源激素的濃度至適宜程度，能很好地控制愈傷組織的形成，并不影響芽的增值系數(shù)［14］。在不定根的誘導(dǎo)時，較容易產(chǎn)生泡沫根，選取適宜的激素濃度，以及將不定根的誘導(dǎo)時間控制在15 d以內(nèi)，及時煉苗并移入營養(yǎng)杯中培養(yǎng)，能很好地誘導(dǎo)不定根的形成并提高組培苗的大田成活率。

經(jīng)對苦瓜組培苗的長勢初步分析發(fā)現(xiàn)，其生長勢普遍比其對應(yīng)的種子苗弱，但組培苗的葉色、分枝性以及各種果實形態(tài)特征、單瓜重量和單株產(chǎn)量與種子苗無明顯差異，這與謝啟鑫等［15］的研究結(jié)果也一致，說明苦瓜組培苗在常規(guī)育苗栽培條件下產(chǎn)量水平不高，需要進行相關(guān)的配套技術(shù)研究來提高產(chǎn)量水平。

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