甘薯莖尖快速剝離及成苗技術(shù)研究

辛國(guó)勝，邱鵬飛，商麗麗，韓俊杰，張 磊，李美玲，王 鵬，劉慶昌

（1山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094）

甘薯莖尖快速剝離及成苗技術(shù)研究

辛國(guó)勝1，邱鵬飛1，商麗麗1，韓俊杰1，張 磊1，李美玲1，王 鵬1，劉慶昌2

（1山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100094）

以優(yōu)質(zhì)食用型甘薯品種‘煙薯25’為材料，在室內(nèi)和田間條件下，進(jìn)行不同莖尖剝離方式對(duì)比試驗(yàn)、莖尖成苗對(duì)比試驗(yàn)、病毒檢測(cè)試驗(yàn)、試管苗快繁試驗(yàn)以及產(chǎn)量對(duì)比試驗(yàn)，研究甘薯高效脫毒的最佳方式。結(jié)果表明：采用“一刀切”的莖尖剝離技術(shù)平均莖尖成活率和成苗率比常規(guī)的層層剝離技術(shù)分別高219.2%和429.7%，莖尖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.08 mg/L IBA＋0.06mg/L 6-BA；經(jīng)病毒檢測(cè)，采用“一刀切”技術(shù)病毒脫除率為50%，而常規(guī)技術(shù)為25%；通過(guò)6種不同快繁培養(yǎng)基配方的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/L GA為最理想的快繁培養(yǎng)基；經(jīng)田間產(chǎn)量對(duì)比分析，脫毒苗鮮薯產(chǎn)量比不脫毒苗平均增產(chǎn)19.9%、薯干增產(chǎn)19.6%，單株結(jié)薯數(shù)增加0.6塊，大中薯率提高3.8%。

甘薯；脫毒；莖尖快速剝離；快繁

在甘薯中已鑒定出20余種病毒和類病毒，它們能造成甘薯產(chǎn)量、品質(zhì)逐年下降［1-2］。病毒在甘薯中依賴胞間連絲和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流兩種途徑傳播，莖尖是病毒不能到達(dá)和存活的組織［3-4］，因此，莖尖脫毒是解決甘薯病毒病的主要措施［5］。當(dāng)前的莖尖剝離技術(shù)是將無(wú)菌材料放于解剖鏡下，逐層剝離到帶1—2個(gè)葉原基為止，然后切取0.2—0.4 mm的莖尖［5-10］，為防止剝離出的莖尖變干，應(yīng)選擇熒光燈或玻璃纖維燈為好，同時(shí)在材料下要墊一塊濕潤(rùn)的無(wú)菌濾紙［11］。由于甘薯莖尖剝離是在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，無(wú)菌風(fēng)持續(xù)在吹，雖然下面墊濕潤(rùn)濾紙，但由于操作時(shí)間長(zhǎng)，很容易造成莖尖干燥，致使成活率下降。針對(duì)這種情況，煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選擇通過(guò)國(guó)家鑒定的優(yōu)質(zhì)食用型甘薯品種‘煙薯25’作為試驗(yàn)材料，探討創(chuàng)新甘薯莖尖的快速剝離方法，以期達(dá)到脫毒效果好、剝離速度快、成活率高的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以通過(guò)國(guó)家鑒定的優(yōu)質(zhì)食用型甘薯品種‘煙薯25’作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖分生組織植株再生

1.2.1.1 外植體處理 選擇完好、無(wú)病害、未經(jīng)脫毒的‘煙薯25’薯塊在培養(yǎng)箱中萌發(fā)薯苗，等薯苗長(zhǎng)至18 cm左右，剪取1 cm左右頂芽，用0.1%的多菌靈消毒8 min，清水沖洗10 min左右，然后用濾紙吸干表面水分，在超凈工作臺(tái)上先用70%乙醇浸泡10 s，無(wú)菌水沖洗后，再用0.1%HgCl2消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次后待用［5-6］。

1.2.1.2 莖尖剝離 將消毒好的‘煙薯25’頂芽利用解剖鏡于無(wú)菌環(huán)境下切取0.2—0.4 mm微莖尖，試驗(yàn)采用兩種方法：一是采用常規(guī)的層層剝離方法（以下標(biāo)注為a），莖尖帶1—2個(gè)葉原基；二是剝離到還剩5—6層時(shí)，采用“一刀切”的快速剝離技術(shù)，即一刀切下，然后用解剖針?lè)蛛x的快速剝離技術(shù)（以下標(biāo)注為b）。

1.2.1.3 莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配方設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。處理1：MS＋0.1 mg/L IAA＋0.1 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)20 d后轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上；處理2：MS＋0.08 mg/L IBA＋0.06 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)20 d后轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上；處理3：MS＋0.1 mg/L IBA＋0.07 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)20 d后轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基上。

1.2.1.4 莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件 光照14 h/d，光強(qiáng)1 500—2 000 lx，溫度25—28℃，100 mL三角瓶，每瓶

裝入培養(yǎng)基25 mL，接種1個(gè)莖尖，塑料薄膜封口。每處理接種10瓶，2次重復(fù)。

1.2.2 ‘煙薯25’脫毒苗的馴化與病毒檢測(cè)

將經(jīng)誘導(dǎo)及培養(yǎng)獲得的‘煙薯25’莖尖苗培養(yǎng)30—50 d，待苗長(zhǎng)到8—10 cm時(shí)，進(jìn)行單或雙莖節(jié)段繁殖，一般每株切取4—5段，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基或改良的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，30 d左右每個(gè)莖尖苗即可形成多個(gè)植株，待多個(gè)植株長(zhǎng)到7 cm以上時(shí)，選取其中一部分進(jìn)行馴化，將瓶苗移至大棚內(nèi)消毒過(guò)的通氣性較好的地塊內(nèi)，用塑料進(jìn)行拱形覆蓋，5—6 d后逐步打開塑料，在大棚的自然溫光條件下馴化，馴化成功后即可嫁接指示植物進(jìn)行病毒檢測(cè)，本研究選用的指示植物為巴西牽牛［12］。嫁接方法：將待檢測(cè)的甘薯莖端嫁接到長(zhǎng)有3—4片葉的巴西牽牛幼苗側(cè)干上，套上塑料袋5 d后，解袋，10—15 d病毒就會(huì)在巴西牽牛體內(nèi)繁殖積累，如果巴西牽牛嫁接后新生葉出現(xiàn)黃化、明脈、褪綠斑點(diǎn)、沿脈變色等癥狀［13-14］，則說(shuō)明該株系帶病毒，無(wú)癥狀說(shuō)明該株系不攜帶病毒。鑒定結(jié)果中若一個(gè)莖尖苗系中有一株帶有病毒，則需淘汰整個(gè)莖尖苗系，鑒定無(wú)病毒的莖尖苗可以進(jìn)行擴(kuò)繁。

1.2.3 脫毒試管苗的組培快繁

1.2.3.1 植物材料 以經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)確定無(wú)毒的‘煙薯25’試管苗為材料，進(jìn)行單或雙莖節(jié)段繁殖［15-16］。培養(yǎng)基采用三角瓶（100 mL）分裝，每瓶裝25 mL培養(yǎng)基，接種3個(gè)莖節(jié)。培養(yǎng)15 d后，觀察植株長(zhǎng)勢(shì)（強(qiáng)：平均株高＞5 cm、莖粗＞0.3 cm，中：平均株高3—5 cm、莖粗0.2—0.3 cm，弱：平均株高＜3 cm、莖粗＜0.2 cm）、根系發(fā)育（好：平均根系長(zhǎng)＞6 cm、粗＞0.08 cm，中：平均根系長(zhǎng)4—6 cm、粗0.06—0.08 cm，差：平均根系長(zhǎng)＜4 cm、粗＜0.06 cm），并測(cè)定成活率、節(jié)間長(zhǎng)度、莖粗、莖高。

1.2.3.2 培養(yǎng)基處理 設(shè)6個(gè)固體培養(yǎng)基處理。pyj1：MS不加激素；pyj2：MS＋0.04 mg/L IBA；pyj3：MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/L GA；pyj4：1/2MS不加激素；pyj5：1/2MS＋0.04 mg/L IBA；pyj6：1/2MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/L GA。

1.2.3.3 培養(yǎng)條件 每處理接種10瓶，3次重復(fù)，在25℃左右、光強(qiáng)2 000—3 000 lx、14 h/d光照條件下培養(yǎng)［17］。

1.2.4 ‘煙薯25’脫毒苗的增產(chǎn)效果

試驗(yàn)設(shè)脫毒與非脫毒兩個(gè)處理，脫毒苗選用經(jīng)病毒檢測(cè)無(wú)病毒的快繁原種苗，非脫毒苗選擇非脫毒種薯萌發(fā)的薯苗，試驗(yàn)地點(diǎn)在煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院2號(hào)試驗(yàn)地，采取隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)5行區(qū)，行長(zhǎng)3 m，行距0.8 m，面積12 m2，于2012年5月12日栽插，栽植密度62 430株/hm2；10月13日收獲，大田生長(zhǎng)期153 d。每小區(qū)測(cè)中間3行鮮薯產(chǎn)量，3次重復(fù)平均數(shù)據(jù)作為最終產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘煙薯25號(hào)’莖尖分生組織植株再生研究

兩種莖尖剝離方式3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基共計(jì)6個(gè)處理（其處理分別用a＋1、a＋2、a＋3、b＋1、b＋2、b＋3表示），接種7—10 d后，成活的莖尖開始形成愈傷組織，莖尖開始變綠。接種10—18 d后，愈傷組織繼續(xù)膨大，芽開始轉(zhuǎn)綠并萌動(dòng)生長(zhǎng)。20 d后，成活的莖尖轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)30—40 d，此時(shí)各處理的莖尖成苗率有差異，采用“一刀切”的莖尖剝離技術(shù)平均莖尖成活率和成苗率分別為53.3%和33.3%，比常規(guī)的層層剝離技術(shù)（平均莖尖成活率和成苗率分別為16.7%和6.7%）分別提高219.2%和429.7%。“一刀切”的莖尖剝離技術(shù)3種培養(yǎng)基的處理中，以MS＋0.08 mg/L IBA＋0.06 mg/L 6-BA莖尖誘導(dǎo)效果最好，莖尖成活率為60.0%，成苗率為40.0%，“一刀切”的莖尖剝離技術(shù)3種處理的莖尖成活率顯著高于常規(guī)技術(shù)。說(shuō)明采用“一刀切”的莖尖剝離技術(shù)，配合MS＋0.08 mg/L IBA＋0.06 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是‘煙薯25’莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳方法（表1、圖1、圖2）。

圖1 傳統(tǒng)的層層莖尖剝離方法Fig.1 The traditional peeling method of stem tip w ith layer by layer

表1 不同剝離技術(shù)與外源激素對(duì)‘煙薯25’莖尖分生組織培養(yǎng)的影響Table 1 Effects of different stripping technology and exogenous hormones on the stem tip m eristem culture of‘Yanshu 25’

圖2 “一刀切”的莖尖剝離技術(shù)Fig.2 ‘One size fits all’stripping technology of stem tip

2.2 ‘煙薯25’脫毒苗的馴化與病毒檢測(cè)

將經(jīng)誘導(dǎo)及培養(yǎng)獲得的25個(gè)‘煙薯25’莖尖苗進(jìn)行擴(kuò)繁、馴化成功后，用指示植物巴西牽牛進(jìn)行嫁接病毒檢測(cè)，每株系嫁接5株，最終確定了a＋2-2、b＋1-3、b＋1-5、b＋2-1、b＋2-3、b＋2-5、b＋2-7、b＋2-8、b＋3-1、b＋3-3、b＋3-4株系無(wú)病毒癥狀，常規(guī)層層剝離技術(shù)有1個(gè)株系不帶病毒，病毒脫除率為25%，而通過(guò)快速剝離技術(shù)得到的20個(gè)株系，10個(gè)株系不帶病毒，病毒脫除率為50%（表2）。

2.3 ‘煙薯25’脫毒試管苗的組培快繁研究

將確定無(wú)病毒的株系按6個(gè)處理進(jìn)行試管苗快繁試驗(yàn)，在15 d時(shí)，觀察植株長(zhǎng)勢(shì)、根系發(fā)育，并測(cè)定成活率、節(jié)間長(zhǎng)度、莖粗、莖高。結(jié)果表明：6個(gè)處理中，以處理3和處理6綜合性狀最好，成活率、根系發(fā)育、生長(zhǎng)勢(shì)均最好，節(jié)間長(zhǎng)度、莖粗、莖高以處理3最高，處理6次之。因此MS、1/2MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/L GA可以作為‘煙薯25’試管苗快繁的理想培養(yǎng)基，考慮到節(jié)間長(zhǎng)度長(zhǎng)有利于單莖節(jié)扦插快繁操作［18-19］，確定MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/LGA為‘煙薯25’試管苗快繁最理想的培養(yǎng)基（表3）。

表2 ‘煙薯25’脫毒莖尖苗的病毒檢測(cè)Table 2 Virus detection of virus-free stem tip seed ling of‘Yanshu 25’

表3 不同快繁培養(yǎng)基對(duì)‘煙薯25’的試管苗繁殖效果Table 3 The propagation effects of‘Yanshu 25’p lantlets in different propagation medium

2.4 ‘煙薯25’脫毒苗的增產(chǎn)效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，‘煙薯25’脫毒苗比非脫毒苗生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，單株結(jié)薯數(shù)增加0.6塊，大中薯比率提高3.8%，脫毒苗增產(chǎn)效果顯著，鮮薯產(chǎn)量平均增產(chǎn)19.9%，達(dá)極顯著水平；薯干產(chǎn)量平均增產(chǎn)19.6%，達(dá)顯著水平（表4）。

表4 ‘煙薯25’脫毒苗的增產(chǎn)效果及顯著性測(cè)驗(yàn)（t測(cè)驗(yàn)）Table 4 Stim ulation effects of‘Yanshu 25’virus-free seed lings and significance test of average yield（t-test）

3 結(jié)論與討論

絕大多數(shù)無(wú)性繁殖植物均容易感染病毒病，如馬鈴薯［6］、甘蔗［20］、牡丹［21］、鐵皮石斛［22］等，解決脫毒問(wèn)題只能靠莖尖培養(yǎng)，有些植物如馬鈴薯先經(jīng)高溫處理后，再進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，脫毒效果更好［10］。利用莖尖剝離技術(shù)對(duì)甘薯進(jìn)行脫毒也是行之有效的［1-4］，很多材料中均沒有提出詳細(xì)的莖尖剝離技術(shù)，大都籠統(tǒng)地表述為利用鑷子等工具剝離至0.2—0.3 mm或剝離至剩余1—3片葉原基［7-9］。當(dāng)前常用的甘薯莖尖剝離技術(shù)主要采用層層剝離法［9］，在實(shí)際操作中，操作難度較大，極易損傷莖尖組織，致使成苗率較低。而且傳統(tǒng)的層層剝離法增加了莖尖剝離的操作時(shí)間，容易造成莖尖干燥，這也可能導(dǎo)致莖尖成苗率低。針對(duì)這些實(shí)際問(wèn)題，煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提出了“甘薯莖尖快速剝離技術(shù)”，這套技術(shù)不只是局限于剝離環(huán)節(jié)，還包含了試驗(yàn)材料的快速生長(zhǎng)培育（有利于莖尖的分離）、看準(zhǔn)部位一刀切下的把握水平、莖尖組織分離等環(huán)節(jié)。該技術(shù)操作方便、快速，由于有外層葉原基的保護(hù)，莖尖不容易遭到破環(huán)，也不容易干燥，因此成活率提高，且隨著技術(shù)的熟練，容易獲得更小的莖尖，從而提高脫毒效果。本研究中，層層剝離法剝離的莖尖成活率最高僅為10%，而新技術(shù)莖尖成活率和成苗率分別為53.3%和33.3%，比常規(guī)的層層剝離技術(shù)分別提高219.2%和429.7%。

本研究在病毒檢測(cè)時(shí)采用了指示植物巴西牽牛進(jìn)行病毒檢測(cè)，研究表明，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、可以排除外界環(huán)境毒源的干擾、不受季節(jié)限制、成本低等優(yōu)點(diǎn)［20，22］。利用該技術(shù)檢測(cè)的常規(guī)剝離技術(shù)得到的4個(gè)株系只有1個(gè)株系不帶病毒，說(shuō)明傳統(tǒng)方法剝離難度大，剝離越小，成苗率越低，而成活的多為剝離較大的，因此帶毒率相對(duì)較高。新方法在莖尖剝離過(guò)程中對(duì)誤操作造成莖尖過(guò)大的材料，一般選擇丟棄，只保留小的莖尖，因此帶毒率相對(duì)較低。

在莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方的選擇上，很多材料均采用較高的激素濃度，莖尖誘導(dǎo)率較高［7-11］，但均沒有對(duì)后代變異情況做出分析。本試驗(yàn)考慮到高濃度激素容易引起莖尖變異，在試驗(yàn)中設(shè)定的激素濃度較低，雖然莖尖誘導(dǎo)率較低，但在生產(chǎn)實(shí)踐中，沒有發(fā)現(xiàn)變異株。

本試驗(yàn)主要是針對(duì)甘薯莖尖進(jìn)行的剝離方式及成苗技術(shù)的研究，有利于解決目前甘薯莖尖脫毒存在的剝離困難、成苗率低或不成苗等難題，為甘薯脫毒提供了一種新的技術(shù)，對(duì)更好解決生產(chǎn)上因病毒病危害造成產(chǎn)量、品質(zhì)下降的問(wèn)題具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Research on the technology of seedling and rapid stripping of sweet potato stemtip

XIN Guo-sheng1，QIU Peng-fei1，SHANG Li-li1，HAN Jun-jie1，ZHANG Lei1，LIMei-ling1，WANG Peng1，LIU Qing-chang2
（1Yɑntɑi Acɑdemy of Agriculturɑl Sciences，Yɑntɑi265500，Chinɑ；2ChinɑAgriculture University，Beijing 100094，Chinɑ）

Comparison experiments of different stem tip stripping ways，stem tip seedling，yield，and experiments of virus detection and rapid propagation of plantlets in laboratory and field were conducted to study the best way of detoxification of sweet potato，taking high quality edible sweet potato variety‘Yanshu 25’as material.The results showed that the stem tip survival rate and seedling rate of“one size fits all”stripping technology were 219.2%and 429.7%higher than those of conventional peeling technology，the bestmedium for stem tip culture was MS＋0.08 mg/L IBA＋0.06 mg/L 6-BA.After virus detection，the virus removal rate of“one size fits all”technology could reach 50%，while that of the conventional technique was 25%.Experiments of different propagation culture showed that MS＋0.04 mg/L IBA＋0.05 mg/L GA was the best one.Field tests showed that fresh yield and dry matter yield of virus-free seedlings increased by 19.9%and 19.6% respectively.The tuber number per plant increased 0.6，and the rate of large and medium potato increased by 3.8%.

Sweet potato；Detoxification；Rapid stripping of stem tip；Propagation

S632.04

A

1000-3924（2017）01-069-05

2015-09-21

國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-11-C-09）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-10-011-02）；國(guó)家“863”計(jì)劃（2012AA101204）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GNC111004）

辛國(guó)勝（1972—），男，碩士，研究員，主要從事甘薯遺傳育種、栽培及脫毒組培研究。E-mail：guoshengx＠sina.com