腫瘤特異性成像中分子探針驗證模型的建立及評估

霍天龍，楊碩，李天然，康鈺，趙赟赟，杜湘珂

1.北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科，北京100044；2.解放軍95醫(yī)院 放射科，福建 莆田 351100

腫瘤特異性成像中分子探針驗證模型的建立及評估

霍天龍1，楊碩1，李天然2，康鈺1，趙赟赟1，杜湘珂1

1.北京大學(xué)人民醫(yī)院 放射科，北京100044；2.解放軍95醫(yī)院 放射科，福建 莆田 351100

目的建立同一個體裸鼠腫瘤受體陽性和陰性雙瘤動物模型。方法選取 SSTR2 陽性表達細胞系人BEL-7402細胞系和SSTR2陰性表達細胞系人 A549細胞系，進行細胞培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞，消化和懸浮后，分別移植到同一裸鼠各一側(cè)腋窩（移植細胞懸液濃度在 5×106個/0.2 mL/側(cè)以上），制作皮下移植瘤雙瘤模型，觀察成瘤效果，對成瘤效果進行分析和總結(jié)。結(jié)果成功進行了2種細胞的細胞培養(yǎng)，采用腋窩作為注射部位，成功制造了BEL-7402/A549雙瘤模型。其中BEL-7402成瘤率在80%以上（24/30），接種細胞的量足夠即可很好地成瘤；A549細胞濃度在5×106個/0.2 mL以上成瘤率略低，約73%（22/30），增加細胞數(shù)量和補充注射可以部分提高成瘤率。最終雙側(cè)成瘤大小相差在1 cm以內(nèi)的占32%（8/22）。組織學(xué)檢查顯示，與裸鼠正常肝臟相比，裸鼠肝臟移植腫瘤明顯呈惡性形態(tài)，細胞核大，多見病理性核分裂像，雙核或多核多見；腫瘤組織可見明顯壞死區(qū)和 大量血管分布，提示生長迅速和微血管較多。A549移植瘤和BEL-7402移植瘤大體形態(tài)不同，但微觀形態(tài)同BEL-7402一樣，與人腫瘤形態(tài)一致。結(jié)論同一裸鼠個體可以成功接種不同腫瘤，掌握好兩種腫瘤的生長差別，可以制作出大小相差在允許范圍的合適的雙瘤模型，為腫瘤特異性成像奠定基礎(chǔ)。

分子影像學(xué)；動物模型；裸鼠移植瘤；雙瘤模型；分子探針

引言

惡性腫瘤是當今威脅人類健康的最大頑疾之一，其中尤以晚期腫瘤的療效最差。因此，現(xiàn)階段治療惡性腫瘤的關(guān)鍵在于早期診斷，而分子影像學(xué)即是早期診斷的希望。分子影像學(xué)立足于從細胞和分子水平顯示病變，是一種特異性的、全新的活體顯像方法。分子影像學(xué)可使我們從整體上了解疾病的發(fā)生、發(fā)展，在原位揭示生化改變，減少有創(chuàng)的檢查，對疾病進行早期檢測、鑒別定性以及治療評價[1]。

合適的腫瘤模型是完成腫瘤早期成像和特異性成像的基礎(chǔ)。以往研究僅在同一個體單純構(gòu)建目標腫瘤受體陽性動物模型，同時利用不同個體構(gòu)建目標受體陰性腫瘤作為對照，因此這種對照方式存在內(nèi)在缺陷，效果欠理想。若能在同一個體同時構(gòu)建目標受體陽性腫瘤和對應(yīng)的目標受體陰性腫瘤模型則是解決問題的關(guān)鍵，它可以有效地克服不同個體在不同時間和生理狀態(tài)下分子探針分布偏移，從而客觀和直觀驗證分子探針特異性，完成腫瘤受體特異性顯像。有鑒于此，本研究選擇高表達SSTR2受體的人BEL-7402陽性細胞系和不表達SSTR2的人A549細胞系進行同一裸鼠個體雙側(cè)移植瘤模型制作，科學(xué)直觀地完成受體定量特異性顯像，為分子探針特異性和腫瘤早期特異性成像奠定基礎(chǔ)。60%～70%時適時凍存。

（1）凍存程序：將欲凍存細胞消化、懸浮后，用15 mL離心管低速離心（800 r/min）7 min，收集細胞，吸去上清；用1.5 mL凍存液吹打細胞，將其完全移入將凍存管，旋緊管口；將凍存管放入冰箱，4℃約40 min；置于普通冰箱上層冰盒（約-20℃），30～60 min；-30℃放置30 min左右；-70℃或-80℃過夜；做好標記后，將凍存管放入凍存格內(nèi)，然后放入液氮罐。

（2）凍存液配方：小牛血清89%，DMSO（分析純，Sigma-2650）10%，雙抗1%。

1.2 雙瘤模型建立

BEL-7402和A549腫瘤細胞傳代、生長到一定數(shù)量，取對數(shù)生長期細胞，用0.25%的胰酶（含0.04%的EDTA，欣惠澤奧生物科技有限公司）消化、離心、調(diào)整細胞數(shù)，使其達到5×106個/0.2 mL以上。選4周齡雄性Balb/c裸小鼠（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物培育中心提供，全部實驗小鼠都在無特定病原體環(huán)境下飼養(yǎng)，體重15～18 g），于其雙腋窩部皮下分別注射腫瘤細胞約5×106個/0.2 mL，進行模型構(gòu)建?？紤]到二者成瘤速度不同，預(yù)實驗掌握好時間差，盡量使HCC移植瘤和對照瘤相差不大（直徑最好在1 cm左右）。選取二者體積相近的成功模型進行后續(xù)實驗。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

BEL-7402人肝癌細胞系來源于北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系，A549人肺癌細胞系來源于北京大學(xué)人民醫(yī)院呼吸科實驗室。使用前，解凍、復(fù)蘇，將細胞離心收集，除去凍存液后，在超凈臺（CJ-IS，天津泰斯特儀器有限公司）中，用含 10%小牛血清（北京金澤奧生物科技有限公司）和雙抗（青霉素和鏈霉素各100 U/mL）的DMEM低糖完全培養(yǎng)液（北京博奧圖瑞生物科技有限公司）1.5 mL重新懸浮細胞，將懸液完全吸入75 cm2Corning培養(yǎng)瓶（北京天悅基因生物科技有限公司），補足培養(yǎng)液后，置于37℃，5%CO2孵箱（北京迪索公司）中培養(yǎng)。待細胞長到

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

狀態(tài)良好的培養(yǎng)細胞在倒置顯微鏡下觀察，形態(tài)為典型腫瘤細胞形態(tài)，排列緊密，核大，核漿比高，多呈多邊形，邊界清楚，內(nèi)含顆粒，折光較強，見圖1。

圖1 BEL-7402（a）和A549（b）細胞培養(yǎng)圖片

2.2 雙瘤模型建立

采用腋窩作為注射部位，成功制造了BEL-7402/A549雙瘤模型，見圖2。其中BEL-7402成瘤率在80%以上（24/30）。接種細胞的量足夠（濃度在5×106個/0.2 mL以上）即可很好地成瘤。A549細胞濃度在5×106個/0.2 mL以上成瘤率略低，約73%（22/30），增加細胞數(shù)量和補充注射可以部分提高成瘤率最終雙側(cè)成瘤大小相差在1 cm以內(nèi)的占32%（8/22）。

圖2 雙瘤模型鼠

2.3 組織學(xué)檢查

掃描結(jié)束后，處死裸鼠，提取腫瘤組織，一半組織低溫保存，備用；另一半組織用10%Formaldehyde 固定，梯度酒精脫水后，石蠟包埋切片，梯度酒精復(fù)水，常規(guī)HE染色觀察，觀察腫瘤形態(tài)和血管密度。

組織切片（HE染色）顯示，腫瘤明顯呈惡性形態(tài)，細胞核大，多見病理性核分裂像，雙核或多核多見；腫瘤組織可見明顯壞死區(qū)和大量血管分布，提示生長迅速和微血管較多，見圖3～4。

圖3 A549腫瘤組織病理圖片（HE 200×）

圖4 腫瘤組織病理圖片（HE 200×）

3 討論

分子影像學(xué)的內(nèi)涵決定了其必定能在腫瘤的早期診斷和鑒別定性方面發(fā)揮不可替代的作用。分子影像學(xué)的特點和基本任務(wù)就是利用分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究成果，圍繞病變發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)特異性分子，用化學(xué)的和生物學(xué)的方法構(gòu)建特異性分子探針，用影像學(xué)手段在分子水平進行成像，從而達到對疾病進行早期診斷和鑒別定性的目的。

生長抑素是一種存在于人腦、下丘腦、胃腸、胰腺等部位內(nèi)分泌細胞中的活性多肽，具有廣泛的生理作用，能抑制生長激素、消化道激素等激素的分泌，抑制胰腺和胃的外分泌，作為中樞神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，還可調(diào)節(jié)正常細胞和腫瘤細胞的分化增殖，具有抗增殖作用。生長抑素在體內(nèi)是通過與生長抑素受體（Somatostatin Receptor，SSTR）結(jié)合而發(fā)揮生理功能的。生長抑素受體有五種亞型（Subtype），分別稱為SSTR1-5。正常情況下，SSTR表達很少。與正常組織相比，腫瘤組織SSTR表達顯著增多。大多數(shù)腫瘤如肝細胞癌主要表達SSTR2或SSTR5亞型[1]。

能模擬和復(fù)制人類疾病的動物模型是研究腫瘤成像的關(guān)鍵。經(jīng)典的人肝癌細胞系BEL-7402表達高SSTR2，用此細胞系構(gòu)建的裸鼠皮下移植瘤模型，可以很好地模擬人肝癌，并具有相應(yīng)的生物學(xué)特性。針對SSTR2構(gòu)建分子探針可以完成腫瘤特異性成像。實際情況下，分子探針是否具有特異性是能否檢出特定腫瘤的關(guān)鍵，因此特異性探針的驗證方法非常重要。

目前一般有3種方法，即探針分子亂序?qū)Ρ?、特異性阻斷實驗和雙瘤模型。其中雙瘤模型實施難度較大，除選擇合適的受體陽性/陰性細胞系配對外，掌握和平衡二者的的成瘤模式也非常關(guān)鍵。但最能科學(xué)、直觀驗證分子探針特異性的方法就是雙瘤模型。Weissleder等[2]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）陽性和陰性雙瘤模型，證明雙瘤模型是可行的。因此，選取SSTR2表達陰性的腫瘤細胞系和SSTR2表達陽性的腫瘤細胞系，分別移植到裸鼠體內(nèi)，可構(gòu)建裸鼠雙瘤模型。研究證明，人BEL-7402肝癌細胞系高表達SSTR2[3]，且移植瘤成功后，腫瘤組織亦高表達SSTR2。Singh等[4]用RT-PCR方法證明，人非小細胞肺癌細胞系（NSCLC cell lines）A549、H460和H1299 SSTR2表達陰性；國內(nèi)趙榮等[5]用Western blot方法也證明A549細胞不表達SSTR2。因此，選用高表達SSTR2的人肝癌BEL-7402細胞系和不表達SSTR2的人非小細胞肺癌A549細胞系在同一裸鼠個體制造雙腫瘤模型，根據(jù)SSTR2表達不 同，分子探針結(jié)合量會出現(xiàn)明顯差別，因此同一個體雙側(cè)構(gòu)建雙瘤模型是一種極好的方法，通過不同的增強效果可以直觀地驗證分子探針特異性，完成肝癌的特異性成像，為肝癌的早期診斷和鑒別診斷提供新方法[6-10]。

合適的動物模型對驗證探針是否有效非常關(guān)鍵[11-14]。雙瘤模型憑借在裸鼠腋窩雙側(cè)種植SSTR2不同表達程度的腫瘤，可以“直觀地”看到由于SSTR2表達不同而產(chǎn)生的雙側(cè)腫瘤的顯像差異，從而可靠地評價分子探針是否有作用[15-16]。了解兩種細胞系不同的成瘤速度和成瘤特點，掌握二者成瘤規(guī)律，以便分別在不同時間開始移植腫瘤，最后達到在特定實驗時間窗內(nèi)二腫瘤體積差別在一個合理范圍，有利于成像。

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Establishment and Evaluation of Molecular Probe Verification Model in Brain Tumor Specific Imaging

HUO Tian-long1, YANG Shuo1, LI Tian-ran2, KANG Yu1, ZHAO Yun-yun1, DU Xiang-ke1
1.Department of Radiology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China; 2.Department of Radio-logy, the 95thHospital of PLA, Putian Fujian 351100, China

ObjectiveTo establish a dual-tumor animal model in one nude mouse which positively and negatively expresses a specific receptor respectively.MethodsThe human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 (positively expressed SSTR2) and the human lung cancer cell line A-549 (negatively expressed SSTR2) were selected and cultured respectively. Then cells in logarithmic growth phase were digested and suspended for transplantation to the bilateral axillary fossa of the same nude mouse (the concentration of the cells suspended were over 5×106/0.2 mL), so as to establish the dual-tumor epidermal xenograft nude mouse model. The effects of the tumor transplantation were observed and analyzed.ResultsThe two kinds of cell lines were successfully cultured; the BEL-7402/A549 dual-tumor nude mouse xenograft model was successfully established in the bilateral axillary fossa of one nude mouse. The tumor formation rate of BEL-7402 cell line was above 80% (24/30), and it was easy to form the tumor if the cell number was large enough. Whereas the tumor formation rate of A549 cell line was relatively low, which was about 73% (22/30) over a concentration of 5×106/0.2 mL, and the success rate of tumor formation could be increased via cells augmentation or secondary injection. The number of the bilateral tumor whose size difference was within 1 cm was accounted for 32% (8/22). The histological examination showed that the hepatocellular carcinomas dissected from the tumor-bearing nude mice were typically malignant form compared with normal mice liver, the cell nucleus was large, pathologic mitosis were commonly seen with dual or multi nucleus. The obvious necrosis and abundant vessels were seen in tumors which suggested that the tumor grew fast and the micro-vessels were rich. Although the general form of the A549 transplantation tumors were different from the BEL-7402 transplantation tumors, the micro-morphology form of the two tumors were consistent with the corresponding tumors of human beings.ConclusionThe different tumor of cell lines could be inoculated to the same nude mouse to successfully develop the dual-tumor models. To well-control the growth difference of the two kindsof tumors could establish the size-proper tumor models, so as to lay a foundation for tumor specificityimaging.

molecular imaging; animal model; nude mouse xenograft; dual-tumor model; molecular probe

R81；R445.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.03.003

1674-1633(2017)03-0010-04

2017-01-13

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金新教師類（2011000 1120083）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81372363）。

霍天龍，副主任醫(yī)師，主要研究方向為分子影像學(xué)。

通訊作者郵箱：huotianlong@bjmu.edu.cn