黑猩猩腸道阿米巴原蟲的純化培養(yǎng)及形態(tài)觀察

鄒 瑩， 陳 蓉， 章小小， 李俊嫻， 王德云

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 江蘇南京210095 ； 2.南京紅山森林動物園， 江蘇南京210028)

黑猩猩腸道阿米巴原蟲的純化培養(yǎng)及形態(tài)觀察

鄒 瑩1， 陳 蓉2， 章小小2， 李俊嫻2， 王德云1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 江蘇南京210095 ； 2.南京紅山森林動物園， 江蘇南京210028)

1915年，本園1只黑猩猩經(jīng)常反復(fù)出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便鏡檢發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲包囊，用藥后病愈。現(xiàn)采集該黑猩猩慢性感染期糞便進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)該黑猩猩為結(jié)腸內(nèi)阿米巴和迪斯帕內(nèi)阿米巴或溶組織內(nèi)阿米巴混合感染。使用營養(yǎng)瓊脂雙向培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)成滋養(yǎng)體(后期進(jìn)行分子鑒定為迪斯帕內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體)并對其進(jìn)行形態(tài)觀察，為日后鏡檢鑒定提供了依據(jù)，并為其分子學(xué)鑒定提供了蟲體原料。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基配制 本試驗(yàn)采用經(jīng)楊光友等人改良后的營養(yǎng)瓊脂雙相培養(yǎng)基[1-2]，其中A固體部分包括牛肉浸膏1.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂7.5 g和B部分液體。B液體部分包括NaCl 8 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、MgCl20.01 g、Na2HPO42 g、KH2PO40.3 g、蒸餾水1 000 mL。

先配制液體部分，CaCl2和MgCl2分裝于不同的容器，其他液體部分同裝一個容器，高壓滅菌，充分冷卻后混合均勻。取500 mL混合液加入固體部分，沸水浴2～3 h，完全溶解后趁熱分裝試管，每管5 mL。高壓滅菌后趁熱放成斜面，冷卻，放入冰箱中保存?zhèn)溆茫嘞碌?00 mL液體保留。接種前，每管中加B部分液體4.5 mL、兔血清0.5 mL、滅菌米粉20 mg、青霉素1 000 lU和鏈霉素2 000 μg。

1.2 糞樣處理與形態(tài)觀察 糞樣取自本園的圈養(yǎng)黑猩猩。取新鮮糞樣常規(guī)碘染鏡檢，初步鑒定是否有碘染的阿米巴包囊。向盛有50 g糞便的小燒杯加入適量蒸餾水，攪拌至混合均勻，結(jié)合260目篩過濾。將濾液于離心機(jī)中3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀的糞泥作接種用[3]。吸取處理后的糞樣接種至配好的營養(yǎng)瓊脂雙向培養(yǎng)基，每管100 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，后每24 h取培養(yǎng)液進(jìn)行1次形態(tài)學(xué)觀察。出現(xiàn)大量的成熟期四核包囊后，取100 μL培養(yǎng)液接種于新的培養(yǎng)基中促進(jìn)包囊破解為滋養(yǎng)體及滋養(yǎng)體的繁殖[4-5]。

2 結(jié)果

2.1 糞便中阿米巴包囊及囊后滋養(yǎng)體 糞樣直接鏡檢可見未成熟的、成熟的迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊、成熟的結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊以及由于染色質(zhì)量不高而分辨不出的包囊和囊后滋養(yǎng)體。所見的未成熟迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊多為單核包囊，圓球形，直徑為15 μm左右，有囊壁，1個核，擬染色體和糖原泡染色不明顯(圖1a)。成熟的迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊為感染期包囊，無擬染色體和糖原泡，有4個泡狀核，包囊碘染后呈淡棕色，直徑13 μm左右，內(nèi)外質(zhì)分解明顯[6](圖1b)。成熟的結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊(圖1c)包囊較大，10～20 μm，圓球形，染色較淺，可見近8個細(xì)胞核，未見到糖原體和擬染色體，可見核仁，內(nèi)外質(zhì)分解明顯。核周染色質(zhì)粒分布不均，核仁大，多偏位。囊后滋養(yǎng)體(圖1d)呈不規(guī)則扁圓形，較包囊稍大，直徑約20 μm，不運(yùn)動，內(nèi)質(zhì)與外質(zhì)分界不明顯。

2.2 培養(yǎng)基中阿米巴包囊與滋養(yǎng)體 培養(yǎng)1周后，培養(yǎng)基中基本變?yōu)槌墒旒磳⑵平庖莩龅乃暮说纤古羶?nèi)阿米巴包囊[7](圖2a)。接種入新培養(yǎng)基的阿米巴包囊48 h后基本消失，培養(yǎng)基中可見大量運(yùn)動力不足的滋養(yǎng)體(圖2b)與少數(shù)活性強(qiáng)盛快速運(yùn)動的滋養(yǎng)體(圖2c)，折光性較強(qiáng)。蟲體圓形或橢圓形，直徑9～20 μm，進(jìn)行二分裂繁殖。內(nèi)置顆粒小而均勻，細(xì)胞核1個，核膜內(nèi)緣有一層排列整齊的染色質(zhì)粒，中央有一核仁。能運(yùn)動的個體大多呈長葫蘆形，具透明偽足，以翻滾、擺動和旋轉(zhuǎn)的方式行定向運(yùn)動[8-9]。

圖1 阿米巴包囊與囊后滋養(yǎng)體

a:未成熟迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊(400×)；b:成熟迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊(400×)； c:成熟結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊(400×)；d:囊后滋養(yǎng)體(400×)

圖2 迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊與滋養(yǎng)體

a:成熟迪斯帕內(nèi)阿米巴包囊(1 000×)； b:運(yùn)動力不足的滋養(yǎng)體(400×)； c:快速運(yùn)動的滋養(yǎng)體(400×)

3 討論

阿米巴類感染在動物園動物中發(fā)現(xiàn)率不低，尤以靈長類的腸道感染居多[10～12]。腸道阿米巴原蟲，種類雖多，但惟有溶組織內(nèi)阿米巴被認(rèn)為有致病力，可引起膿血痢疾、肝膿腫、肺膿腫等病變。因此，不同種腸道阿米巴的形態(tài)觀察及鑒別在臨床診斷上有著重要意義。1993年重新劃出的新的種-迪斯帕內(nèi)阿米巴與溶組織內(nèi)阿米巴形態(tài)相似、生活史相同，從形態(tài)上無法鑒定[13]，常誤診。結(jié)腸內(nèi)阿米巴直徑略大于溶組織內(nèi)阿米巴，在我國與其平行分布，發(fā)現(xiàn)時有必要繼續(xù)尋找后者[14]。

結(jié)腸內(nèi)阿米巴和迪斯帕內(nèi)阿米巴在包囊形態(tài)上有較為明顯的區(qū)別。本試驗(yàn)有以下總結(jié)：兩者包囊都有囊壁，且其未成熟的包囊都常有較大糖原泡，但結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊較大，細(xì)胞核1～8個，多為8個，呈亮圈狀。迪斯帕內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體內(nèi)質(zhì)顆粒小而均勻，結(jié)腸內(nèi)阿米巴則含有食物泡。若顯像清楚，可看見迪斯帕內(nèi)阿米巴核周染色質(zhì)粒大小均勻，排列整齊，核仁小，多位于中央。結(jié)腸內(nèi)阿米巴則核周染粒粗，排列不規(guī)則，核仁也較大，常為偏心位。擬染色體偶見，呈碎片狀。

結(jié)腸內(nèi)阿米巴和迪斯帕內(nèi)阿米巴能夠通過包囊形態(tài)直接區(qū)別，但是迪斯帕內(nèi)阿米巴和溶組織內(nèi)阿米巴在形態(tài)和生活史上相同。此外，迪斯帕內(nèi)阿米巴是無侵襲性的阿米巴[13]，感染率是溶組織內(nèi)阿米巴的9倍，過去估計的溶組織內(nèi)阿米巴感染率中很可能90%屬于迪斯帕內(nèi)阿米巴感染[6]。因此，在臨床中發(fā)現(xiàn)溶組織內(nèi)阿米巴感染或發(fā)病時，注意排除迪斯帕內(nèi)阿米巴感染，從而指導(dǎo)臨床用藥。

該黑猩猩糞樣直接鏡檢時發(fā)現(xiàn)了較大量結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊與一些囊后滋養(yǎng)體，說明其為兩種阿米巴原蟲混合感染。但在接種培養(yǎng)基后，僅迪斯帕內(nèi)阿米巴生長為滋養(yǎng)體。造成這種現(xiàn)象是由于迪斯帕內(nèi)阿米巴活力較強(qiáng)，并且所采集為用藥后的糞便，結(jié)腸內(nèi)阿米巴較為敏感，導(dǎo)致純化培養(yǎng)時僅迪斯帕內(nèi)阿米巴生長。

在眾多阿米巴分離培養(yǎng)基中，僅血清和米粉是不可缺少的。采用傳統(tǒng)的LES培養(yǎng)基多次培養(yǎng)后的阿米巴蟲體會出現(xiàn)生長衰退、偽足變短、蟲體變圓、甚至無繁殖能力等退化現(xiàn)象[15]。經(jīng)楊光友等人改良后的培養(yǎng)基改進(jìn)了這一狀況，降低了培養(yǎng)成本，縮短了培養(yǎng)時間，提高了培養(yǎng)質(zhì)量，其繁殖的滋養(yǎng)體數(shù)在48 h后能達(dá)到最大值[1-2]。但在本試驗(yàn)中，繁殖出一定量的滋養(yǎng)體用時較長，并且由糞樣直接培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)包囊成熟后難以破裂，需再一次接種于新的培養(yǎng)基才能逸出滋養(yǎng)體。其原因是在體內(nèi)感染時，感染性包囊攝入后需在回腸末端或結(jié)腸中性或堿性環(huán)境中，通過蟲體運(yùn)動和腸道內(nèi)酶的作用才能使蟲體脫囊逸出。本次試驗(yàn)的糞樣采取并非在宿主發(fā)病期，且宿主前期有甲硝唑服用史，糞便中包囊基本為單核包囊，因此包囊前期的培養(yǎng)比較困難，也用時很長。同時，該培養(yǎng)基作為多生態(tài)培養(yǎng)基，經(jīng)過長時間的培養(yǎng)，其pH值下降，甚至變?yōu)樗嵝原h(huán)境，不利于蟲體脫囊。

迪斯帕內(nèi)阿米巴與結(jié)腸內(nèi)阿米巴均為無致病力的阿米巴，可見該黑猩猩糞檢見大量阿米巴包囊應(yīng)該是腹瀉的繼發(fā)現(xiàn)象，也不排除蟲體內(nèi)共生菌致病的可能性。臨床遇見此類情況時，應(yīng)在對癥治療的同時對蟲體進(jìn)行鑒定，以確定其是不是真正病原，以免誤診延長病程。此類阿米巴雖無致病力，當(dāng)也可在動物疾病發(fā)生時大量增殖加重病情，因此要注意飼料、飲水衛(wèi)生，做好消毒與滅蟲，避免不同品種不同個體間的交叉感染。此外，已感染個體的糞便內(nèi)包囊數(shù)量也可做腸道健康狀況的指征，指導(dǎo)獸醫(yī)在動物出現(xiàn)臨床癥狀前的預(yù)防性用藥。

[1] 楊光友，黃道超，姜波，等. 凹甲陸龜溶組織內(nèi)阿米巴原蟲病的病原分離培養(yǎng)與鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29(4):248-251.

[2] 姜波.獼猴溶組織內(nèi)阿米巴原蟲病病原分離鑒定及凝集素hgl基因的原核表達(dá)[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué).2008.

[3] 劉慧，孫曉東，聶仁華，等. 3種方法檢測糞便中溶組織內(nèi)阿米巴的結(jié)果比較[J]. 中國病原生物學(xué)雜志，2008，3(9):679-680,789.

[4] Clark C G，Diamond L S. Methods for Cultivation of Luminal Parasitic Protists of Clinical Importance[J]. Clin Microbiol Rev，2002，15(3):329-341．

[5] Thelma H Dunnebacke. The Ameba Balamuthia mandrillaris Feeds by Entering into Mammalian Cells in Culture[J]. J EUKARYOT MICROBIOL，2007，54(5):452-464.

[6] 夏夢巖，高飛，李小靜，等.阿米巴病的實(shí)驗(yàn)診斷研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)臨床商務(wù)化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊，2002，23(2):91-92

[7] 陳建平，王光西. 人體寄生蟲學(xué)彩色圖譜[M]. 成都:四川大學(xué)出版社，2004:I-5.

[8] 劉鳴一. 在不同條件下溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體的形態(tài)觀察[J]. 動物學(xué)雜志，1988，23(3):1-2.

[9] 崔黎明，劉利，施雨露，等. 溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體在液體培養(yǎng)基中運(yùn)動方式的觀察[J]. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，24(6):589.

[10] 李健，全琛宇，施維，等.廣西地區(qū)人工馴繁獼猴、食蟹猴胃腸道寄生蟲感染情況的初步調(diào)查[J]．實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2013，33(4):279-284．

[11] 呂向輝，陳旭旭，袁美群，等. 圈養(yǎng)川金絲猴、獼猴腸道寄生蟲感染及其形態(tài)觀察[J]. 經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報，2010，14(2):92-95.

[12] 蔡娟，喬繼英，張旭，等. 陜西圈養(yǎng)珍稀野生動物腸道寄生蟲感染及其形態(tài)觀察[J]. 動物學(xué)雜志，2009，44(3):63-69.

[13] Myjak Przemyslaw, Kur Józef, Pietekiewicz Halina, Kotlowski Andrzej,etal. Molecular Differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar from Stool and Culture Samples Obtained from Polish Citizens Infected in Tropics and in Poland[J]. Acta Protozool，2000，39: 217-224.

[14] 葉砒婧，姚輝，向左甫. 非人靈長類腸道寄生蟲研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(12):5384-5388，5391.

[15] 陶紅，施自倫，周麗麗，等. 阿米巴原蟲病的實(shí)驗(yàn)診斷研究進(jìn)展[J]. 中外健康文摘，2010，29(7):28-30.

2016-04-28

鄒瑩(1991—)，女，碩士生，主要從事動物疾病研究, E-mail: 2015807152@njau.edu.cn

王德云，E-mail: dywang@njau.edu.cn

S852.71

B

0529-6005(2017)02-0104-02