乳鼠肌源干細(xì)胞的培養(yǎng)及其成肌分化的實驗研究

任振敏　馬東禮　黃錦桃　李朝紅　謝富康

肌源干細(xì)胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)存在于肌纖維的肌膜與基板之間，多處于靜息期，在肌肉組織損傷并需要修復(fù)時大量增殖，它維持著肌肉組織的自我更新[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs在一定條件下可分化為骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞[2]、甚至神經(jīng)細(xì)胞[3]。MDSCs作為種子細(xì)胞，已用于壓力性尿失禁[4]、杜氏肌營養(yǎng)不良[5]、心肌疾病[6]等較多疾病的治療研究。本研究的目的就是體外培養(yǎng)MDSCs并初步探討其成肌特性，為以后的基因治療和組織工程奠定基礎(chǔ)。

對象與方法

1.對象：新生3～5 d的SD乳鼠(中山大學(xué)動物實驗中心提供)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(天津TBD公司)，Dispase酶(Roche公司)，Cardiac troponin T抗體(Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、明膠、膠原酶I、DAPI、乙酰膽堿、α-銀環(huán)蛇毒素試劑購于Sigma公司，PBS平衡液、結(jié)蛋白(desmin)單克隆抗體、骨骼肌肌球蛋白(skeletal myosin)抗體購于博士德公司。

生長培養(yǎng)基(DMEM/F12+20%FBS)、分化培養(yǎng)基(DMEM/F12+5%FBS)。

2.MDSCs的分離、純化和培養(yǎng)：新生3～5 d的SD乳鼠，于無菌條件下取后肢骨骼肌，放在0.1 mol PBS液中，解剖顯微鏡下剔除筋膜、肌腱、血管和脂肪組織。將肌組織塊用PBS沖洗3遍，用解剖剪將組織塊剪成1 mm3大小，移入離心管中，再用PBS反復(fù)吹打3次，靜置1 min后，棄去上層液體和漂浮組織。按每克肌肉2 ml混合消化酶(Dispase 2.4 U/ml，0.2% collagenase，2.5 mmol/L CaCl2)進(jìn)行消化，37 ℃，1 h，加5倍體積的DFl2+20% FBS終止消化，反復(fù)吹打后經(jīng)200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心，重懸。

反復(fù)差速貼壁法(preplate)純化MDSCs：將細(xì)胞懸液吸入經(jīng)明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2 h，貼壁的細(xì)胞為PPl(preplate1)；未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，貼壁的細(xì)胞為PP2 (preplate2)；未貼壁的細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，貼壁的細(xì)胞為PP3(preplate3)；未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，貼壁的細(xì)胞為PP4(preplate4)，供進(jìn)一步細(xì)胞鑒定和分化實驗用。

原代培養(yǎng)第1天首次換液，以后每3天換液一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合，換用分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況及肌管自發(fā)性收縮現(xiàn)象。

3.MDSCs的鑒定：將生長狀態(tài)較好的細(xì)胞經(jīng)消化后種于爬片上，第2天取出爬片；PBS小心沖洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS沖洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封閉30 min；加一抗desmin(小鼠抗人，1∶100)，4 ℃過夜；PBS沖洗3遍：加TR標(biāo)記的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室溫避光保濕孵育1 h；PBS沖洗3遍；DAPI復(fù)染核15 min；PBS洗3遍，過雙蒸水1遍：適量緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

4.肌管的Skeletal myosin、cardiac troponin T免疫熒光鑒定：六孔板中生長狀態(tài)較好的肌管，吸干廢液；PBS小心沖洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS沖洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封閉30 min；加一抗skeletal myosin(小鼠抗兔，1∶100)或cardiac troponin T(小鼠抗大鼠，1∶200)，4 ℃過夜；PBS沖洗3遍；加TR標(biāo)記的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室溫避光保濕孵育1 h；PBS沖洗3遍；DAPI復(fù)染核15 min；PBS沖洗3遍，過雙蒸水一遍；適量緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

5.肌管乙酰膽堿受體的鑒定：α-銀環(huán)蛇毒素試劑已與熒光染料羅丹明結(jié)合,可在熒光顯微鏡下發(fā)紅光。原試劑濃度為100 μmol/L，用分化培養(yǎng)基配制成終濃度為10 nmol/L供實驗用。乙酰膽堿為粉末狀，用分化培養(yǎng)基配制成終濃度為10 nmol/L供實驗用。將培養(yǎng)4 d的肌管吸去培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基洗3遍,實驗組加入配好的銀環(huán)蛇毒素，37℃孵育60 min；對照組加入配好的乙酰膽堿30 min，分化培養(yǎng)基洗3遍后，再加入配好的銀環(huán)蛇毒素，37℃孵育60 min；實驗組和對照組吸去銀環(huán)蛇毒素，PBS洗3遍；4%PFA固定20 min；PBS洗3遍；超純水洗1遍；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，PP2、PP3、PP4得到的單位視野MDSCs陽性率的兩兩比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.MDSCs的純化和培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下觀察，混合酶消化后，剛接種的細(xì)胞呈圓形，折光性強。PP1、PP2細(xì)胞貼壁迅速，細(xì)胞數(shù)量多，生長迅速，PP3、PP4細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞折光性強，貼壁緩慢，PP4用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)1天，細(xì)胞形態(tài)逐漸變成梭形，隔3天換液一次，待細(xì)胞生長至70%～80%后傳代。培養(yǎng)第二代的細(xì)胞增殖到70%～80%時，加入分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)第4天，形成粗大的肌管，可見多個細(xì)胞核排列在肌管的中央，培養(yǎng)第6天，逐漸沿一個方向平行排列，部分肌管相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1)。

A.培養(yǎng)1天的PP1；B.培養(yǎng)1天的PP2；C.培養(yǎng)1天的PP3；D.培養(yǎng)1天的PP4；E.PP2培養(yǎng)6天分化成的肌管；F.PP3培養(yǎng)6天分化成的肌管；G.PP4培養(yǎng)6天分化成的肌管 圖1　混合酶消化法和preplate分離純化的MDSCs及分化成的肌管(bar=100um)

2.MDSCs的鑒定：Desmin是肌肉特異性的中間絲蛋白，是最早表達(dá)于活化的肌源性干細(xì)胞的蛋白之一，存在于骨骼肌、心肌及平滑肌細(xì)胞的胞漿中，在維持肌細(xì)胞的形態(tài)和功能方面起著重要的作用，也是國內(nèi)外研究者鑒定MDSCs最常用的指標(biāo)[7-8]。圖2A顯示經(jīng)Desmin免疫熒光檢測，MDSCs呈陽性反應(yīng)為紅色，DAPI染細(xì)胞核呈藍(lán)色，20倍物鏡下隨機數(shù)20個視野的細(xì)胞，PP4中Desmin陽性反應(yīng)的細(xì)胞約占90%。單位視野PP2、PP3、PP4的陽性細(xì)胞率分別為29.3%(454/1 550)、75.5%(657/870)、89.6%(448/500)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.肌管的鑒定：Skeletal myosin為骨骼肌特有的功能蛋白，是肌衛(wèi)星細(xì)胞分化形成肌管和成熟骨骼肌的標(biāo)志。Cardiac troponin T是心臟特有的心肌蛋白，是存在于心肌肌原纖維中細(xì)肌絲上的收縮調(diào)節(jié)蛋白。主要調(diào)節(jié)心肌收縮過程中粗、細(xì)肌絲之間的相對滑行，近幾年來被用于鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的標(biāo)志[9]。乙酰膽堿受體(AchRs)是骨骼肌發(fā)育過程中最早出現(xiàn)的膜蛋白。AchRs在肌纖維表面高濃度聚集表達(dá)被認(rèn)為是分化為成熟骨骼肌纖維的標(biāo)志，并伴隨著AchRs電生理的變化[10]。α-銀環(huán)蛇毒素特異性與神經(jīng)肌肉接頭的N-AchR結(jié)合，阻斷Ach作用于乙酰膽堿受體，因此，可被用來鑒定骨骼肌細(xì)胞的乙酰膽堿受體。肌管經(jīng)skeletal myosin和Cardiac troponin T免疫熒光染色呈陽性為紅色，DAPI染細(xì)胞核呈藍(lán)色(見圖2B、圖2C)。圖3顯示在培養(yǎng)第4天MDSCs分化為肌管后，用α-銀環(huán)蛇毒素-羅丹明染色后,在肌管表面呈紅色聚集成簇的乙酰膽堿受體表達(dá)，但在預(yù)先用乙酰膽堿孵育后，由于AchRs已與乙酰膽堿結(jié)合,再用α-銀環(huán)蛇毒素-羅丹明來染色，未見呈紅色團(tuán)塊狀聚集的乙酰膽堿受體的表達(dá)。

討論

長期以來，肌組織的正常發(fā)育和修復(fù)全部歸功于肌衛(wèi)星細(xì)胞，但這一結(jié)論被分離得到的一類多能干細(xì)胞打破，這類細(xì)胞被稱為側(cè)群干細(xì)胞。Bhagavati等[11]從肌組織中分離得到側(cè)群干細(xì)胞，將其注射到經(jīng)過致死劑量射線照射后的小鼠血管內(nèi)，發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞可以持續(xù)增殖并分化為幾乎所有類型的血細(xì)胞，證實了其自我更新和多潛能分化的能力，因而也被賦予MDSCs的名稱。對于肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)，受到的關(guān)注和研究較多，而MDSCs的培養(yǎng)在國內(nèi)較少見。因此，本研究擬在體外培養(yǎng)乳鼠肌源干細(xì)胞，并探討其成肌分化的能力，為今后的細(xì)胞移植或基因治療提供種子細(xì)胞。

Dispase酶是一種中性蛋白酶，與分離細(xì)胞常用的胰酶相比，對細(xì)胞損害小，且它可以消化細(xì)胞外基質(zhì)，有利于干細(xì)胞的釋放[12-13]。Qu-Petersen等[12]用膠原酶、Dispase酶、胰蛋白酶逐步消化從而分離MDSCs。與之不同，本實驗利用膠原酶、Dispase酶混合消化，簡化了操作步驟，且未使用胰蛋白酶，從而減少了對細(xì)胞的損傷。目前最常用的MDSCs純化方法主要有preplate[12]、密度梯度離心法[14]、流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠法。Preplate即反復(fù)差速貼壁法，是根據(jù)成纖維細(xì)胞貼壁速度快，而MDSCs貼壁速度慢的特點,將成纖維細(xì)胞去除,提高M(jìn)DSCs的純度。本實驗用此方法純化，得到的PP3、PP4從細(xì)胞形態(tài)上看可描述為兩類，一類頗似肌衛(wèi)星細(xì)胞的短梭形，一類為小圓形。這與Qu-Petersen等[12]對肌源干細(xì)胞形態(tài)描述頗為相似。

MDSCs幾乎沒有特異性表面標(biāo)志物，國內(nèi)外大部分實驗室檢測Desmin(肌源性標(biāo)志物)對其進(jìn)行鑒定，本研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)差速貼壁到PP4時，經(jīng)Desmin鑒定純度達(dá)到近90%。

肌管形成是MDSCs成肌分化的標(biāo)志，本實驗中除形態(tài)上的變化外，肌管同時表達(dá)了骨骼肌特異性蛋白Skeletal myosin、心肌特異性蛋白Cardiac troponin和骨骼肌的膜蛋白AchRs。Skeletal myosin和AchRs的表達(dá)說明MDSCs已向著成熟骨骼肌纖維分化，AchRs表達(dá)的鑒定在國內(nèi)外的研究中較少見。有大量研究將Cardiac troponin作為嗅球[15]、骨髓[16]、脂肪等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定，本研究將其用于鑒定MDSCs成肌分化的一個標(biāo)志，為以后的心肌疾病的細(xì)胞治療打下基礎(chǔ)。

肌管的自發(fā)性收縮現(xiàn)象，目前國內(nèi)外均有報道，但對于這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因沒有定論。趙科研等[17]在收縮的細(xì)胞中加入終濃度為0.1 μmol/L的異丙腎上腺素(isoproterenol，IP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入IP后細(xì)胞收縮頻率比加入前平均增加約18.4次/分鐘，說明肌源干細(xì)胞表面可能有?受體的存在。本試驗在肌管培養(yǎng)過程中，也發(fā)現(xiàn)了肌管有自發(fā)性收縮現(xiàn)象。

綜上所述，本實驗采用混合酶消化法和preplate分離純化，成功地獲得了具有成肌分化能力的MDSCs，為骨骼肌疾病、心肌疾病、泌尿系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療奠定了基礎(chǔ)。

(圖2、圖3見封底)

1Takacs EB.The potential use of cytokines and stem cell homing signals in the treatment of stress urinary incontinence.J Urol,2007,177：1227-1228.

2肖菲,趙戰(zhàn)魁,劉波,等.兔骨骼肌干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的實驗研究.武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,34:209-212.

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14Che X,Guo J,Wang B,et al.Rapid isolation of muscle-derived stem cells by discontinuous Percoll density gradient centrifugation.In Vitro Cell Dev-An,2011,47:454-458.

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17趙科研，俞世強，蔡振杰,等．大鼠成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)及其自發(fā)收縮特性．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004,25：34-36．