成纖維細(xì)胞激活蛋白α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

陳淵，蘇志鵬，金涌，鄭偉明

（1.臺(tái)州市立醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 臺(tái)州 318000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江溫州 325015）

成纖維細(xì)胞激活蛋白α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

陳淵1，蘇志鵬2，金涌1，鄭偉明2

（1.臺(tái)州市立醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 臺(tái)州 318000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江溫州 325015）

目的:探討成纖維細(xì)胞激活蛋白α（FAP-α）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)33例神經(jīng)膠質(zhì)瘤和7例正常對(duì)照腦組織中FAP-α蛋白的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析。同時(shí)對(duì)所有病例進(jìn)行隨訪，分析FAP-α表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一步檢索腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(kù)（Rembrandt）探討FAP mRNA表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤之間FAP-α蛋白的積分光密度值（IOD）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)存在正相關(guān)（r=0.673，P＜0.01）。7例正常腦組織FAP-α蛋白不表達(dá)或表達(dá)弱陽(yáng)性，與低級(jí)別膠質(zhì)瘤（P＜0.05）和高級(jí)別膠質(zhì)瘤（P＜0.01）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FAP-α蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與患者性別、腫瘤大小、年齡以及手術(shù)切除程度無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。生存分析顯示FAP-α低表達(dá)組和高表達(dá)組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），F(xiàn)AP-α的表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）。檢索腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)FAP mRNA低表達(dá)預(yù)后明顯好于高表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論:FAP-α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在表達(dá)，且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)正相關(guān)，其高表達(dá)可能提示不良預(yù)后。

成纖維細(xì)胞激活蛋白α；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，盡管隨著顯微手術(shù)的進(jìn)步，腫瘤的切除率得到很大的提高，化療、放療的應(yīng)用以及手術(shù)、化療、放療的綜合治療，使得患者的預(yù)后得到一定的改善，仍存在腫瘤易復(fù)發(fā)，患者病死率高，生存時(shí)間短的難題。研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞激活蛋白α（fibroblast ac-tivation protein α，F(xiàn)AP-α）在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等一系列過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-3]。國(guó)內(nèi)目前關(guān)于FAP-α表達(dá)與膠質(zhì)瘤關(guān)系的報(bào)道較少。本研究通過(guò)探討FAP-α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，從而揭示FAP-α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義，以期為進(jìn)一步研究FAP-α在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)，為膠質(zhì)瘤的診斷及預(yù)后判斷提供新的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 33例膠質(zhì)瘤蠟塊取自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科保存的2007年至2011年間手術(shù)標(biāo)本，其中男17例，女16例；年齡9～74歲，平均年齡45.2歲。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色明確為膠質(zhì)瘤，參照2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)確定病理診斷和分級(jí)。其中I級(jí)5例，I I級(jí)9例，I I I級(jí)10例，IV級(jí)9例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療，術(shù)后接受正規(guī)治療。正常對(duì)照腦組織7例均取自因顱腦損傷行顱內(nèi)減壓術(shù)的患者，常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋。所有標(biāo)本切片避開壞死、囊性變、鈣化部分。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆FAP-α（ab-53066-100）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔二步法檢測(cè)試劑盒（PV-9001）和DAB顯色試劑盒（ZLI-9017）購(gòu)自北京中杉金橋有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 組織切片采用免疫組織化學(xué)超敏二步法，按照PV-9001免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。每例標(biāo)本同時(shí)用PBS代替一抗染色作為陰性對(duì)照。采用雙盲法閱片，胞膜或胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，即FAP-α（+）。在光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野（×400）采集圖像，應(yīng)用美國(guó)Media Cybernetics Image公司設(shè)計(jì)的Image-Pro Plus6.0軟件選取并分析陽(yáng)性區(qū)域，計(jì)算積分光密度（IOD）值（IOD=陽(yáng)性區(qū)面積×平均光密度），來(lái)反映陽(yáng)性蛋白的強(qiáng)度或濃度。將所有IOD值按百分位值分成4個(gè)等級(jí): 0～25%，陰性表達(dá)；25%～50%，弱陽(yáng)性表達(dá)；50%～75%，中度表達(dá)；75%～100%，高度表達(dá)。同時(shí)按IOD值的中位數(shù)值分成低表達(dá)組和高表達(dá)組，0～50%為低表達(dá)組，50%～100%為高表達(dá)組。

1.4 隨訪 對(duì)33例膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行隨訪，通過(guò)患者病歷資料采集臨床基本信息，并制定隨訪表，主要以電話隨訪和門診隨訪2種方式?？偵嫫谑侵溉朐喝掌诘交颊咭蚰z質(zhì)瘤或相關(guān)并發(fā)癥而死亡為止，所有患者臨床資料及隨訪資料完整。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩均數(shù)比較用LSD-t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊，用多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用sperman秩相關(guān)性分析。采用Kaplan Meier法進(jìn)行生存分析，并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)；預(yù)后分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAP-α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 在膠質(zhì)瘤組織中，F(xiàn)AP-α的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，分布于腫瘤細(xì)胞的胞膜和（或）胞漿，在正常腦組織中不表達(dá)或弱表達(dá)，見圖1。正常腦組織FAP-α蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤（低級(jí)別和高級(jí)別）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)比低級(jí)別膠質(zhì)瘤和高級(jí)別膠質(zhì)瘤之間FAP-α蛋白的IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 FAP-α陽(yáng)性表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

FAP-α表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小及手術(shù)切除程度無(wú)明顯相關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.673，P＜0.01），其表達(dá)隨腫瘤病理級(jí)別的增高而增強(qiáng)，見表2。

2.3 FAP-α表達(dá)強(qiáng)度與患者預(yù)后的關(guān)系 依據(jù)隨訪條件，本組共隨訪33例，其中15例死亡，18例存活。根據(jù)FAP-α免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)OD值的中位值，把隨訪患者分成低表達(dá)組和高表達(dá)組。生存分析顯示低表達(dá)組和高表達(dá)組兩者生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2，F(xiàn)AP-α的表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05），進(jìn)一步檢索Rembrandt數(shù)據(jù)庫(kù)，探討FAP mRNA與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系（低表達(dá)組n=59，高表達(dá)組n=88），發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

3 討論

圖1 FAP-α蛋白在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（×400）

表1 FAP-α蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（±s）

表1 FAP-α蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（±s）

組別nIOD值正常組 7644.1±269.0低級(jí)別組（I～I(xiàn) I級(jí)）141 690.0±1 471.4a高級(jí)別組（I I I～I(xiàn)V級(jí)）1916 528.0±14 474.2ab與正常組比:aP＜0.05；與低級(jí)別組比:bP＜0.01表2 膠質(zhì)瘤中FAP-α表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系臨床病理特征n低表達(dá)（例）高表達(dá)（例）P性別0.556男17710女16610年齡（歲）0.371＜50231013≥50103 7腫瘤大小(cm)0.377≤4113 8 4～6 93 6≥6137 6病理分級(jí)（WHO）0.002 I+I I級(jí)1410 4 II+IV級(jí)19316手術(shù)切除程度全切135 80.610次全切20812 I

圖2 FAP-α蛋白表達(dá)與生存期的Kaplan Meier曲線

圖3 FAP mRNA表達(dá)與生存期的Kaplan Meier曲線

FAP-α選擇性表達(dá)于90%以上惡性上皮性腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、皮膚黑色素瘤等）基質(zhì)中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中，定位于胞膜和胞漿[4-8]，卻幾乎不表達(dá)于正常組織及良性上皮腫瘤間質(zhì)中靜息成纖維細(xì)胞，且罕見于腫瘤細(xì)胞中。

FAP-α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究較少。前期我們利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot法及RT-PCR法發(fā)現(xiàn)FAP-α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87中存在表達(dá)[9]，這和以往FAP-α只表達(dá)于腫瘤間質(zhì)有所不同。本研究進(jìn)一步在臨床病理標(biāo)本中印證FAP-α分布于腫瘤細(xì)胞的胞漿和（或）胞膜，這與MENTLEIN等[10]的研究結(jié)果相似。STREMENOVA等[11]通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)FAP-α在31例膠質(zhì)瘤和11例正常組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，兩者都存在一定程度的表達(dá)，且與病理級(jí)別相關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)33例膠質(zhì)瘤及7例正常腦組織得出了相似的結(jié)論，膠質(zhì)瘤組織和正常組織兩者的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤表達(dá)的IOD值之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，級(jí)別越高其表達(dá)越強(qiáng)，存在正相關(guān)。另外我們前期的研究結(jié)果顯示抑制FAP-α表達(dá)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖能力下降[9]。這些均提示FAP-α可能參與了腫瘤的惡性進(jìn)展，因此其表達(dá)強(qiáng)度對(duì)判斷膠質(zhì)瘤的惡性程度具有一定的指導(dǎo)意義。

國(guó)內(nèi)外有不少文獻(xiàn)報(bào)道了FAP-α表達(dá)和不同腫瘤患者的臨床病理和預(yù)后之間的關(guān)系。王秋艷等[12]發(fā)現(xiàn)在54例宮頸癌中FAP-α陽(yáng)性率為88.89%，且FAP-α表達(dá)與宮頸癌的臨床分期有關(guān)，提示FAP-α的表達(dá)與宮頸癌演進(jìn)有關(guān)。HENRY等[13]將138例人結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以評(píng)估FAP-α表達(dá)的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間質(zhì)中高表達(dá)FAP-α的結(jié)腸癌患者更易于發(fā)生侵襲性進(jìn)展、潛在的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。FAP-α在胰腺癌中高表達(dá)，腫瘤發(fā)生時(shí)達(dá)到高值，且越高的FAP-α表達(dá)量預(yù)示著越差的預(yù)后[14]。蘇靜等[15]研究了FAP-α在50例宮頸癌間質(zhì)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著宮頸癌組織中FAP-α表達(dá)的增強(qiáng)，腫瘤組織中的微血管密度也明顯增加。趙志娟等[16]在乳腺癌的研究中也得到了類似的結(jié)果。這些研究顯示FAP-α的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)并對(duì)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移起到了一定作用。提示FAP-α可能是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。通過(guò)對(duì)膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP-α的表達(dá)強(qiáng)度與膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡和腫瘤大小以及手術(shù)切除程度無(wú)明顯關(guān)系（P均＞0.05）。生存分析發(fā)現(xiàn)低FAP-α組和高FAP-α組兩者生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），F(xiàn)AP-α的表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素，同時(shí)利用分子腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)FAP mRNA低表達(dá)組預(yù)后明顯好于高表達(dá)組，與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明其在一定程度上可以判斷患者預(yù)后，是一個(gè)有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物。但需要注意的是，本研究的樣本量較小，隨訪時(shí)間短，未來(lái)需要納入更大的樣本量進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪分析。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP-α在膠質(zhì)瘤組織中存在表達(dá)，且與病理級(jí)別正相關(guān)，并可能影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，提示其可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能成為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的指標(biāo)之一。

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（本文編輯：趙翠翠）

Expression of f broblast activation alpha protein in glioma and its signif cance

CHEN Yuan1, SU Zhipeng2,

JIN Yong1, ZHENG Weiming2. 1.Department of Neurosurgery, Taizhou Municipal Hospital, Taizhou, 318000; 2.Department of Neurosurgery, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective：To explore the expression of FAP-α in human gliomas, and its relationship between clinical characteristics and prognosis.Methods：Expression level of FAP-α protein was detected with immunohistochemistry in 33 cases of human gliomas and 7 cases of normal brain tissue, followed by subsequent clinicopathological correlative studies. Meanwhile, all patients were followed up, the relationship between the expression level of FAP-α and the glioma prognosis were studied. Furthermore, brain tumor molecular database (Rembrandt) was searched to investigate the relationship between the FAPmRNA expression and prognosis.Results：Comparing the expression intensities (IOD) of FAP-α protein in low-grade gliomas with those in high-grade gliomas, it was signif -cantly different (P＜0.01); the expressions of FAP-α and the pathological grades of glioma were positively correlated (r=0.673, P＜0.01). There was low or no expression in 7 cases of normal brain tissue; Comparing with low grade glioma (P＜0.05) and high grade glioma (P＜0.01), there was signif cantly difference. The FAP-α expression was not signif cantly correlated with gender or tumor size or surgical degree and age (P＞0.05). By survival analysis, overall survival time was signif cantly difference between the Low FAP-α and High FAP-α (P＜0.01), and the expression of FAP-α was a independent prognostic factor in human gliomas (P＜0.05). According to the results obtained from Rembrandt, patients with high FAP mRNA-expressing glioma showed statistically poorer prognoses compared with patients with low FAP mRNA-expressing glioma.Conclusion：FAP-α is expressed in human gliomas, which is positively correlated with the pathological grade of gliomas, and its high expression may suggest a poor prognosis.

f broblast activation protein α; glioma; immunohistochemistry; prognosis

R739.41

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.007

2016-05-17

浙江省外科學(xué)重中之重學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（kfjj 2011006）。

陳淵（1988-），男，浙江臺(tái)州人，住院醫(yī)師，碩士。

鄭偉明，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:zhwm61@ 126.com。